花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量调查

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　　导语

　　花生粕(Peanut meal)是以脱壳花生果为原料，经提取油脂后得到的副产品。其中蛋白质含量达48.68%，多糖含量达32.50%，并含有Mg、K 等多种矿物质元素，但氨基酸种类不平衡。随着养殖业的迅猛发展，鱼粉需求量大幅度增加，供应量严重不足，用其他蛋白质原料替代鱼粉成为畜禽及水产饲料营养研究的热点。我国花生总产量居油料作物首位，但因其易感染黄曲霉毒素，同时含有影响动物对营养物质消化、吸收及代谢的抗营养因子，主要有胰蛋白酶抑制因子(Trypsin inhibitor，TI)和皂苷(Saponin，S)等，限制其在畜禽水产中的应用。其中，胰蛋白酶抑制因子可以和小肠中的胰蛋白酶及糜蛋白酶结合，形成稳定的复合物，使酶失活，导致蛋白质消化率和利用率降低，动物生长迟缓，饲料转化率降低。皂苷则易增加畜禽肠黏膜细胞的通透性，抑制活性营养的运输，破坏肠细胞结构，与鞣质会形成复合物，毒性增强，还会和锌离子形成不溶复合物，降低锌的吸收率。目前，花生粕中的胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量尚未被调查，鉴于花生品种、制油工艺、操作条件、设备、技术水平的差异，制油之后的花生粕中抗营养因子含量也不尽相同，因此本文阐述花生粕中两种抗营养因子含量范围，并参照豆粕中皂苷提取方法对花生粕中皂苷提取方法中乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声温度和超声功率进行单因素优化，从而获得花生粕中皂苷的最佳的提取方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　酶标仪（Power Wave Xs2美国BioTek公司）、旋转蒸发仪（RE-2000，上海某生化仪器厂）、高功率数控超声波清洗器（KQ-400KDE，昆山市某仪器有限公司）、双层恒温培养振荡器（SPH-2012C，上海某设备有限公司）、恒温水浴箱（SB-9，日本EYELA公司）、高速离心机（Hitachi 公司，日本）。胰蛋白酶抑制因子定量检测试剂盒购自北京某生物工程技术有限公司，齐墩果酸标准品（纯度为99%）购自上海某科技公司，试验用水为Millipore 纯水系统（美国Millipore 公司）制得的高纯水，乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸为分析纯。

　　1.2 样品来源

　　采集来自山东省知名花生油、食品、油脂、饲料及其他企业的21批次(使用环节)的花生粕，其中5批次采用浸提法，剩余均为压榨工艺。

　　1.3 样品测定方法

　　1.3.1 胰蛋白酶抑制因子的测定

　　ELISA测定参照产品说明书。具体过程如下：将待检的花生粕粉碎成60目以上颗粒，称取0.100 g样品于50 ml离心管中，加入30 ml提取液，于25 ℃振荡16 h，静置2 min后，4 000 r/min的速度离心5 min，取上清液用稀释工作液稀释300倍。将样品盒标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准液平行测定两次，记录校准孔和样品孔所在的位置，经过加样、洗板、加酶标试剂、显色，加终止液后于450/630 nm双波下读取吸光度值。

　　吸光率(%)=B/B0×100。

　　式中：B——校准品或样品的平均吸光度值；B0——标准品1的平均吸光度值。

　　校准曲线的绘制：以校准品百分吸光率为纵坐标，以校准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线。

　　1.3.2 皂苷的测定方法

　　1.3.2.1 绘制标准曲线

　　称取齐墩果酸标准品5.0 mg，定容到50 ml，用甲醇（HPLC）配制0.1 mg/ml 的标准储备液。精密吸取齐墩果酸标准溶液0、100、200、300、400 μl及500 μl分别于10 ml离心管中，在50 ℃下氮气吹干，在试管中加入新配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液（称取5 g香草醛加入100 ml冰醋酸中充分溶解）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60 ℃水浴上加热15 min，流水冷却，加冰醋酸5 ml，混匀，酶标仪波长547 nm处测量OD值。以齐墩果酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标做标准曲线。

　　1.3.2.2 花生粕中皂苷提取方法的优化（见表1）

　　样品提取参照阮洪生等对豆粕中皂苷提取方法，并在实验室条件下进行单因素优化。对花生中皂苷的超声时间、提取液浓度（乙醇：水）、料液比、超声温度及超声功率进行单因素试验优化。鉴于前人研究不对提取次数进行优化，提取次数均为2次。表1为花生粕中皂苷前处理条件的单因素优化及结果。通过对试验结果不同处理组进行单因素方差分析，提取方式中超声1 h与2 h差异不显著(P>0.05)，但均显著高于超声3 h处理组，考虑充分提取选取2 h，若时间有限可选取1 h；提取液体积分数(乙醇：水)为70：30和80：20组的提取率显著高于90：10处理组，发现提取液体积分数为80：20时提取率最高；料液比1：25时提取率较低，另外两组的提取率差异不显著(P>0.05)，其中料液比为1：20时提取率最高；超声温度70 ℃和80 ℃的提取率差异不显著(P>0.05)，且均显著高于60 ℃组，其中超声温度70 ℃提取率最高。超声功率70%和80%的提取率显著高于60%处理组，考虑到超声功率较高会引起超声温度变化，并且超声功率为70%时皂苷含量高于80%，因此选用70%的超声功率。最终确定的前处理方法如下：称取一定质量粉碎后的花生粕，按照1：20 的料液比加入体积分数为80%的乙醇溶液，超声浸提2 h，超声温度和功率分别为70 ℃和70%。冷却室温后4 000 r/min离心10 min，转移上清液后，重复上述步骤，合并两次上清液，旋转蒸发至5~10 ml，用去离子水定容至25 ml，涡旋混匀，取200 μl提取液加入10 ml离心管中，50 ℃下氮吹，后续步骤与1.3.2.1氮吹之后的步骤一致。

　　1.4 数据处理与分析

　　采用SPSS 19.0、Excel 2013及酶标软件。

　　2结果

　　2.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量(见表2)

　　由表2 可知，花生粕中TI 平均含量为（2.41±1.21） mg/g，实测值范围为0.73~4.88 mg/g，选择P5（5%的含量小于该值，下同）~P95（95%的含量小于该值，下同）为置信区间，含量范围为0.94~4.80 mg/g。其中5 批次经浸提工艺的样品TI 含量范围为1.27~4.88 mg/g，其余经压榨工艺的样品TI 含量范围在0.73~4.80 mg/g内，表明压榨之后TI含量虽最低，但两种方式的工艺下的TI含量最高水平一致，从而表明TI含量不仅与制油工艺相关，也可能与花生品质、加工参数相关。但浸提法下的均值水平[（2.78±1.32）mg/g]高于压榨方式下的TI均值水平[（ 2.29±1.20）mg/g]，从而表明压榨法较浸提法能较大程度消除TI。

　　2.2 花生粕中皂苷含量(见表2)

　　由表2 可知，花生粕中皂苷平均含量为（7.20±0.18）mg/g，实测值范围为5.74~11.43 mg/g，P5~P95 含量范围为5.78~9.01 mg/g。浸提和压榨工艺下的花生粕中皂苷含量范围分别为5.74~7.67 mg/g 和5.78~11.43 mg/g，均值含量分别为(6.63±0.82) mg/g和(7.38±1.38) mg/g，浸提法较压榨法在含量范围和均值较低，表明浸提法较压榨法去除皂苷程度大。

　　2.3 花生粕中两种抗营养因子含量比较

　　由表2发现，皂苷含量整体高于胰蛋白酶抑制因子含量，花生粕中皂苷含量变异水平低于胰蛋白酶抑制因子，说明现在的制油水平的差异对胰蛋白酶抑制因子影响较大。另外，对花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量进行线性相关性分析发现，二者之间相关性不显著。

　　3讨论

　　3.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子结果分析

　　罗虹等对鲜食花生中的TI进行提取并对其活性进行了测定，活性范围在0.062%~0.451%之间，与本调查中花生粕含量范围接近，表明花生经制油后其内TI没有被大量消除，其原因在于花生TI具有极度耐热性，这与花生TI粗提物经100 ℃水浴15 min，残留活性为对照(25 ℃)的77%；100 ℃水浴1 h，残留活性为对照的68%研究结果一致。李素芬等的研究显示，肉仔鸡饲喂TI 含量最高的生大豆组(4.65%TI/CP)胰腺腺管上皮组织具有明显的增生性变化，细胞体积增大和数量稍有增多，并伴有空泡样变性；随着TI浓度的下降，胰腺腺管细胞增生现象也减轻，且日粮中TI/CP在0.2%~1.97%时饲喂仔鸡胰腺并未出现明显变化。而参照花生粕中粗蛋白质45%计算，花生粕中TI/CP 在0.2%~1.07%，故不会对肉仔鸡产生危害。另外，本研究中花生粕中TI低于豆粕（2.2~61.6 mg/g），也低于发酵豆粕[（ 7.5±7.6）mg/g]和膨化豆粕[（ 18.3±2.3）mg/g]中的平均水平。

　　3.2 花生粕中皂苷结果分析

　　由检测结果可知，花生粕中皂苷含量低于豆科植物皂苷含量范围18~41 mg/g，其原因是加工处理过程中皂苷类化合物会降解流失。孙健在加工方法对菜豆中主要皂苷的影响研究中表明：热处理（高温烹煮、高压灭菌）会导致豆中主要皂苷含量显著流失，同时，皂苷含量<1 g/kg时不会影响主要养殖鱼类。根据本研究结果，在鱼类养殖中建议花生粕使用量不超过17%。刘襄河在饲料中用花生粕替代鱼粉比例达28.6%（花生粕添加量为14%）时，不影响凡纳滨对虾的生长性能、饲料利用率及其免疫功能，因此，本研究中花生粕测定范围为正常范围。单胃动物对皂苷反应不同，鸡比其他单胃动物敏感，日粮中皂苷含量为0.15%可降低肉仔鸡生产性能及产蛋率。按照本研究花生粕中皂苷含量范围，不考虑霉菌污染，花生粕使用范围为19.56%~26.13%。

　　花生粕中皂苷含量（0.578%~0.901%）与大豆饼中皂苷含量水平一致（0.6%~0.9%），高于菜豆荚中皂苷含量（0.097%~0.786%）。苜蓿中含有丰富的皂苷，根部平均含量在1.335%，大于茎(0.596%)和叶(0.655%)中，与花生粕中皂苷平均水平一致，从而表明花生粕中皂苷含量不容小觑。

　　4 结论

　　本研究采集山东省市售使用环节中的21批次花生粕，其中胰蛋白酶抑制因子在0.94~4.80 mg/g含量范围内，含量较低，但不同动物对其耐受性评价有待研究。皂苷含量范围为5.78~9.01 mg/g，高于胰蛋白酶抑制因子，可能是限制花生粕在饲料中应用继霉菌毒素之后的第二因素。浸提法比压榨法制油后的花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量高，皂苷含量低。这两种抗营养因子含量之间相关性不显著；同时，花生粕中皂苷含量高于胰蛋白酶抑制因子含量。该研究数据将有助于了解现行市场中花生粕抗营养因子含量水平，引起饲料企业、制油企业和养殖企业对花生粕中抗营养因子的重视，为花生粕在畜禽水产养殖中的合理使用提供指导意义。

　　来源：饲料工业