酵母水解物中甘露聚糖的检测

畜牧人市场部2

      酵母生物技术和碳水化合物化学的研究进展为解决霉菌毒素问题提供了新方法。研究发现, 存在于酵母细胞外壁的功能型碳水化合物———甘露聚糖对霉菌毒素有很强的吸附能力。人们进一步发现, 酵母细胞能通过吸收毒物和病原菌到细胞壁上来改善动物健康。根据这一研究, 甘露聚糖成为新型霉菌毒素吸附剂研究的重点, 被认为是具有很大开发价值的天然绿色添加剂。

　　酵母甘露聚糖逐渐被各个饲料企业及配方专家们所肯定及应用，但如何选择优质的酵母甘露聚糖产品？如何测定甘露聚糖含量？

　　酵母甘露聚糖的含量

　　甘露聚糖是一种有分支的聚合物，主链以α-1,6糖苷键结合，支链以α-1,2或α-1,3糖苷键结合，约占酵母细胞壁干重的30%。

　　针对目前市场上的酵母甘露聚糖产品，我们推荐酵母水解物中甘露聚糖的含量应≥10%；

　　酵母细胞壁中甘露聚糖的含量应≥20%，总多糖≥45%。

　　酵母甘露聚糖的检测

　　1.原理

　　基于甘露糖在流动相和液相色谱柱的固定相之间具有不同的分配系数，将水解后的样品注入液相色谱，用纯水做流动相，糖类分子流出后，经示差检测器检测，用外标法定量。

　　在甘露聚糖水解时，由于样品可能存在水解不彻底，以及水解产生的葡萄糖和甘露聚糖由于其他高温造成部分发生其他副反应，导致检测结果比产品中实际含量偏低。检测中采用葡聚糖对上述水解过程引起的误差进行修正。

　　2.仪器

　　1) 水浴锅；
　　2) 旋涡混合器；
　　3) 电炉；
　　4) 压力蒸汽灭菌器；
　　5) 高效液相色谱仪：带示差检测器和糖柱（6.5 mm×300 mm，waters sugar pak-1）。

　　3.试剂

　　1) 纯水；
　　2) 盐酸：37%左右；
　　3) 甘露糖：标准品；
　　4) 氢氧化钠：AR；
　　5) 甘露糖标液（2 g/L）：称取甘露糖0.2000 g，用纯水定容至100 ml。
　　6) 葡聚糖对照品（curdlan from Alcaligenes faecalis）: Sigma产品，货号C7821。
　　7) 氢氧化钠溶液：300 g/L。

　　4.操作步骤

　　4.1样品处理

　　准确称取400 mg(精确至0.1 mg)样品放入一个20 ml的耐热玻璃制的带螺帽的小试管中，加入6.0 ml盐酸（37%），小心的将小瓶盖紧后用漩涡混合器混合，得到均一的悬浮液。将小瓶放入30 ℃水浴中处理45 min，每15 min用漩涡混合器震荡混合一次。然后将悬浮物定量的转移到200 ml杜氏瓶中，用约100~200 ml的水，分几次洗涤小试管，洗涤液并入杜氏瓶中。将杜氏瓶放入高压灭菌锅，121 ℃下处理60 min.取出后冷却，用氢氧化钠溶液调将溶液调PH到6~7，然后定容至200 ml。使用0.45 μm孔径的醋酸纤维素膜过滤备用。

　　同时准确称取葡萄糖对照品200 mg，按样品处理方法进行同样的处理。

　　4.2 色谱条件

　　采用纯水作为流动相，流速为0.5 ml/min，柱温80℃，待仪器基线平稳后再进样。

　　4.3标准曲线的绘制

　　分别吸取甘露糖标液1、2、3、4、5 ml到10 ml容量瓶中，用高纯水定容到刻度，得到甘露糖为200、400、600、800、1000 mg/L的标样。在上述色谱条件下准确进样20 μl，得到色谱峰面积和标准物质质量浓度之间的回归方程，绘制标准曲线。

　　4.4样品及对照品的测定

　　在同样的色谱条件下，将处理好的样品和葡聚糖对照品分别注入色谱仪中，记录各色谱峰的保留时间和峰面积。用糖标样色谱峰的保留时间定性，用糖标样色谱峰的峰面积来定量。

　　5.计算结果

　　甘露聚糖的含量按下式计算：

  式中：



　　式中：

　　X—样品中甘露聚糖的含量，%；
　　A1—根据样品溶液的峰面积，在标准曲线上查得的样品溶液的甘露糖的含量，mg/L；
　　A2—根据葡聚糖对照品溶液的峰面积，在标准曲线上查得的样品溶液的葡萄糖的含量，mg/L;
　　m1-—称取样品的质量，g;
　　m2—称取葡聚糖对照品的质量，g;
　　0.2—样品/葡聚糖对照品处理后定容的体积，L；
　　0.9—将甘露糖换算成甘露聚糖的系数；
　　F—样品酸水解中葡萄糖和甘露糖被破坏造成结果偏低的经验补偿系数；
　　P—葡聚糖对照品的纯度（依据试剂厂家提供的检验报告）；
　　W—葡聚糖对照品的水分（依据试剂厂家提供的检验报告）；
　　备注：在同一个实验室内，一般1~2个月检测F值即可。F值在1.25左右，实验室定期对F值进行修正。

　　6.误差分析

　　在重复性检测条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差不得超过下表中所规定的数值：

来源：海宜动物营养公众微信号