第十四届饲料商业配方师研习班问题集锦（一）

畜牧编辑

　
　第14届饲料商业配方师研习班在上海成功召开，以下的问题来自讨论环节的问题。

　　1.如何评估螯合微量元素效价？

　　传统微量元素生物学效价是指动物从一种特定形式的微量元素化合物（如螯合物）中吸收利用该元素（如锌）的程度。实际生产中，某种形式的微量元素的生物学效价常用测定其与该元素另一形式或“标准形式”的效价的比值来表示。在测定有机微量元素生物学效价的试验中，常以微量元素无机盐作为其标准形式，如硫酸锌。目前微量元素生物效价的评估方法根据螯合元素的结构及其功能的不同，有多种方法，如组织含量测定法、斜率比法、微量元素依赖性生物标记法和元素的功效分析法等。组织中微量元素水平实际上反映的是组织中的储存量，而不是吸收后输送到特定组织的微量元素总量。通常，组织中微量元素的储存量会受到排泄、利用或应激的影响。因此，测定组织中的微量元素只能反映部分情况。为了真实地反映生物学效价，需要通过多种方法来综合测定产品的生物学效价很重要，仅通过一种方法测定是不全面的。如锌的生物学效价，可通过测定胫骨中锌的含量和小肠金属硫蛋白mRNA 的表达量，以及体内与锌相关酶的活性如SOD酶活等来综合评估。

　　实际上，除了传统的生物学效价定义，最近的研究结果显示蛋氨酸羟基类似物螯合微量元素的优势不仅限于吸收率高，例如可以增强免疫系统功能，减少胫骨的软骨发育不良及足底组织损伤，减少腿部畸形（弓形腿，外翻足，颤抖腿）并增加骨强度，降低氧化应激和提高生长性能；而且螯合微量元素的应用，可以降低微量元素添加水平，节约矿产资源，减少环境污染，有如环保等诸多方面的效益，这些都是传统效价评估所不能体现的。

　　2.氨基酸金属螯合物的解离，pH降低时，平衡会出现左移金属离子解离吗？左移时随着pH上升，会有什么变化？

　　氨基酸螯合盐在溶液中会有解离平衡，这是一个动态平衡，有对应的稳定常数。在达到平衡态后，降低pH时（使环境呈酸性方向），溶液中H+增加，平衡向生成氨基酸的方向，金属离子与氨基酸配体的解离会增加，游离金属离子浓度增加；当达到平衡态后升高pH（使环境呈碱性方向），也会破坏原有的平衡，造成螯合物解离增加。

　　pH变化后，螯合物解离的程度与螯合盐的稳定常数有关，稳定常数与所用的氨基酸配位体和微量元素都有关，同一种微量元素，不同的氨基酸，稳定常数不同；同一种氨基酸配位体，与不同金属元素所得螯合盐的稳定常数也不同。稳定常数低的解离多，稳定常数高的解离少。羟基蛋氨酸螯合微量元素稳定性好，解离的少。部分螯合物的稳定常数logK见下表1。

　　从表1的数据可以看到微量元素氨基酸螯合物的稳定常数都在103~6或103~10，而有机酸的稳定常数大于102，EDTA的稳定常数都大于1013，螯合物的稳定常数过低和过高都会影响动物的吸收和利用。同一种氨基酸与不同金属元素形成的螯合物稳定常数亦有差别；金属元素与氨基酸的摩尔比时稳定常数增大很多。动物试验研究和实际生产效果都表明：羟基蛋氨酸螯合微量元素在单胃动物胃中的不易溶性，有利于螯合物保持稳定性，这种胃中不易溶解的特性并不影响微量元素在小肠中溶解吸收。

表1  部分螯合物的稳定常数logK

　　3.如何测氨基酸含量和微量元素含量？

　　根据配位体的组成和比例不同及微量元素的特性，可选用的方式有红外光谱法、液相色谱法、原子吸收法、质谱仪、液质联用，等多种方法。如羟基蛋氨酸螯合铜，可以采用傅立叶红外光谱法，测定相关指纹峰的变化情况，与标准品所得的标准曲线对比，回归分析得到氨基酸含量数据。

　　4.红外光谱检测的优缺点？

　　优点，直接，准确，重复性好，不需要液体状态；

　　缺点，仪器设备昂贵，需要有纯的结晶标准品。

　　5.怎样区别真假螯合？

　　一般采用先定性再定量的方法。先用相应微量元素有机和无机态的理化特性，鉴别是有机还是无机，或通过较为复杂理化分析方法红外光谱、示差测热、X射线衍射可以鉴定螯合物产品和混合物。如观察无机盐和螯合盐颜色的差异、溶解特性、用显微镜观察产品结晶的不同，并结合定量鉴定分析来鉴别。 如：蛋氨酸铬与无机铬、无机铬＋蛋氨酸，用甲醇提取后观察提取液颜色，蛋氨酸铬为红紫色，无机铬和无机铬＋蛋氨酸为深绿色。

　　6.关于螯合率？农业部标签？品控方法建立？

　　农业部标签法的正式实施，有利于真假螯合微量元素的甄别。如果产品有可行可靠的测定方法证明产品是真正螯合微量元素，才允许在标签上打“螯合”这一关键词，只能用微量元素与氨基酸的混合物、复合物等关键词，而不能用某氨基酸螯合微量元素。

　　对于品控方法的建立，可以按照前面的定性方法评估之后，确定为真正螯合的微量元素产品的情况下，再对其进行定量测定。定量测定的指标有氨基酸和微量元素含量及螯合率等。

　　重点和难点是螯合率的测定。螯合率是指有机微量元素产品中螯合元素量占总元素量的比例。在螯合物的实际应用中，人们经常把“螯合率”看作一种反应得率。检测螯合率的方法目前有液体法和固体法两种，其中液体法又分两和种，一种是国标GB/T13080.2-2005中运用凝胶色谱法进行检测，通过将氨基酸螯合物试样在水中加热、离心后，分成沉淀和溶液两部分。溶液中所含的可溶性氨基酸鳌合物及金属离子经过凝胶分离，在规定条件下洗脱，金属离子形成氢氧化物沉淀，将固定在凝胶柱顶端无法洗脱，可溶性氨基酸螯合物则可通过配体氨基酸的携带从凝胶柱上洗脱下来，实现和金属离子的分离;可溶性氨基酸螯合物洗脱分离完成后，加人EDTA溶液洗脱，使金属离子从色谱柱上洗脱。用原子吸收光谱法测定沉淀态氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物及金属离子的含量，分别计算出沉淀态氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物占金属元素总量的比例即可计算出相应的氨基酸螯合物的螯合率。但是此方法在实际生产应用中检测极不稳定，容易出现同一批样品多次检测结果不一致的现象。另外一种方法就是采用甘氨酸亚铁国标中检测甘氨酸进行评判，因为某一种特异性氨基酸螯合物中只存在一种氨基酸，如甘氨酸亚铁中只存在甘氨酸，那么我们就可以检测总甘氨酸的含量，再检测游离甘氨酸的含量，用总甘氨酸的含量减除游离甘氨酸的含量，再除以总甘氨酸的含量就可以间接折算出螯合率。此种方法简单易行，准确性高，适合饲料企业实验室操作。

　　液体法针对的是溶解性好的螯合元素产品，主要是单体氨基酸螯合微量元素，如果是不溶或难溶的，用液体法难以测定螯合率，而且在液体在螯合盐会有解离，且受环境中多种因素影响，溶剂的pH 值和浓度对矿物质螯合率的影响很大，会导致测定结果不准确。尽管微量元素体内研究已有一定基础，但是在理想缓冲液中定量测定平衡螯合物的结果与体内真实环境相比，依然相差甚远。消化系统内部并不是平衡状态，除水和缓冲液，还有各种阴离子、阳离子、酶、氨基酸等成分。所以，体外液体状态不能完全代表体内环境，因体内环境无法达到平衡状态。该方法能测定螯合物的螯合率和溶液中样品的螯合率，但不能测定固体样品的螯合率。因此，液态状态下的螯合率并不能反应原产品的螯合效果。

　　因此，固体状态是测定螯合微量元素产品质量和均匀度的首选，特别是用于比较不同的固体有机微量元素产品时。通过检测螯合程度，我们可以确定终产品的质量。为了获得最精确的结果，产品应以固体状态检测。诺伟司开发并验证了傅里叶红外光谱法（FTIR），分析HMTBa与金属元素结合的螯合物。该方法通过标准品曲线，能定量检测出游离或未反应的HMTBa 含量，以及产品中螯合物的总量。


　　感谢诺伟司公司对答案的贡献，在此表示感谢！