植物苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)酶联免疫分析

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本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)水平.用纯化的植物苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入苏云金芽孢杆菌蛋白(BT),再与HRP标记的苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色.TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中植物苏云金芽孢杆菌蛋白(BT)浓度.
试剂盒组成:
试剂盒组成
48孔配置
96孔配置
保存
说明书
1份
1份
封板膜
2片(48)
2片(96)
密封袋
1个
1个
酶标包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
标准品:900ng/g
0.5ml×1瓶
0.5ml×1瓶
2-8℃保存
标准品稀释液
1.5ml×1瓶
1.5ml×1瓶
2-8℃保存
酶标试剂
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
样品稀释液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
显色剂B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
终止液
3ml×1瓶
6ml×1瓶
2-8℃保存
浓缩洗涤液
(20ml×20倍)×1瓶
(20ml×30倍)×1瓶
2-8℃保存
样本处理及要求:
1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心.
2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心.
3. 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心.胸腹水,脑脊液参照实行.
4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集.离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清.检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右.通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份.离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清.保存过程中如有沉淀形成,应再次离心.
5. 组织标本:切割标本后,称取重量.加入一定量的PBS,PH7.4.用液氮迅速冷冻保存备用.标本融化后仍然保持2-8℃的温度.加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分.离心20分钟左右(2000-3000转/分).仔细收集上清.分装后一份待检测,其余冷冻备用.
6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验.若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性.
操作步骤:
标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一,第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一,第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔,第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三,第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五,第六孔中,再在第五,第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五,第六孔中各取50μl分别加到第七,第八孔中,再在第七,第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七,第八孔中分别取50μl加到第九,第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉.(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为600 ng/g,400 ng/g ,200 ng/g,100ng/g, 50 ng/g).
加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同),待测样品孔.在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍).加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀.
温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟.
配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用.
洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干.
加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外.
温育:操作同3.
洗涤:操作同5.
显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).
测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值). 测定应在加终止液后15分钟以内进行.
注意事项:
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存.
浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果.
各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差.一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样.
请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔.如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5).
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染.
底物请避光保存.
严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理.
本试剂不同批号组分不得混用.
10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准.
计算:
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,
在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释
倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值
代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释
倍数,即为样品的实际浓度.
试剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上.
2.批内与批见应分别小于9%和11%
检测范围:
30ng/g-800ng/g

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