预混料中木聚糖酶和植酸酶酶活的测定新方法

kiroco

摘要：本试验选用六和预混料样品，添加定量的KDN自产全细胞酶或植酸酶，利用DNS法检测比较不同方法测得的酶活。结果表明，在稀释酶缓冲液中添加6%的DETA·2Na可以明显提高预混料中木聚糖酶或植酸酶的酶活测定值，采用一次性稀释到位酶样品比分级稀释测得的木聚糖酶或植酸酶的酶活值明显提高。

关键词：预混料 木聚糖酶酶活 植酸酶酶活

饲用酶制剂的应用效果现已毋庸置疑，它既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽生产性能，又能减少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染，因而饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂，在21世纪将有着十分广泛的应用前景。然而酶制剂在饲料中的应用还面临一些问题，其中对于饲料、预混料中的酶活测定方法还不成熟，有些酶由于添加剂量小及饲料中各种干扰因子如重金属离子等影响，实验室测定非常困难，酶活测定结果变异较大。本试验在预混料中添加以木聚糖酶为主的全细胞复合酶或植酸酶，通过不同方法分别测定预混料中的木聚糖酶酶活和植酸酶酶活，目的是探讨比较预混料中酶活测定优化条件，从而为预混料中酶活检测方法提供新思路，为建立一种相对统一的检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试酶制剂

木聚糖酶：由康地恩集团以黑曲霉固体发酵生产的以木聚糖酶为主的全细胞复合酶;

植酸酶：由康地恩集团生产的颗粒植酸酶制剂5000u/g。

1.2 预混料：由山东六和青岛和美饲料有限公司提供。分别为青岛和美 LC633P蛋鸡5%、LC15蛋鸡5%、BC15肉小鸡5%、BC35肉大鸡5%、SB345猪4%、SB44P猪4%、LH660猪4%、EV24鸡4%、BV15肉鸡0.4%、DV14鸭0.4%、BV24肉鸡0.4%。

1.3 木聚糖酶酶活定义

山东六和农牧科技园企业标准Q/SLH002-2006：酶样品于40℃，pH5.0条件下，1min水解木聚糖生成相当于1μg木糖还原物质，即为1个酶活力单位。

1.4 植酸酶酶活定义

国标GB/T6682-1992：样品在植酸钠浓度为5.0 mmol/L、温度37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位。

1.5试验设计

1.5.1试验设计分两部分，一部分选择预混料添加KDN全细胞酶采用不同优化办法进行木聚糖酶酶活比较，另一部分选择预混料添加植酸酶采用不同优化办法进行植酸酶酶活比较。试验设常规对照，即直接测定酶制剂样品的木聚糖酶酶活或植酸酶酶活，作为100%绝对酶活与在预混料中测定酶活进行比较。

简要试验方案如下：

常规(对照组)：1g酶→溶解定容至100ml(稀释缓冲液)容量瓶……;

试验组：0.1g酶+5g预混料混匀(LC633P、LC15、BC15、BC35)→溶解定容……;

试验组：0.1g酶+4g预混料混匀(SB34、SB44P、LH600、EV24)→溶解定容……;

试验组：0.1g酶+0.4g预混料混匀(BV14、DV鸭、BV肉鸡)→溶解定容……。

2.结果与分析

2.1各种预混料中添加KDN全细胞酶后木聚糖酶酶活测定结果(见表1)

表1 各种预混料中添加KDN全细胞酶后测定木聚糖酶酶活

样品木聚糖酶酶活u/g%

KDN全细胞酶+LC633P蛋鸡5%61049379.4

KDN全细胞酶+LC15蛋鸡5%65556185.3

KDN全细胞酶+BC15肉小鸡5%67256887.5

KDN全细胞酶+BC35肉大鸡5%66491486.5

KDN全细胞酶+SB34猪4%68957489.7

KDN全细胞酶+SB44P猪4%73889496.1

KDN全细胞酶+LH600猪4%72869094.8

KDN全细胞酶+EV24鸡4%76610599.7

KDN全细胞酶+BV14肉鸡0.4%73719395.9

KDN全细胞酶+DV鸭0.4%66661586.7

KDN全细胞酶+BV肉鸡0.4%68277288.8

KDN全细胞酶768656100

由表1测定酶活结果可知，大多数预混料中木聚糖酶活实际测定值都集中在655561～766105u/g之间，实际测定酶活表明仍有0.3～15%的酶活没有测定出来。

2.2 LC633P蛋鸡5%预混料中添加KDN全细胞酶酶稀释缓冲液中是否添加EDTA·2Na对木聚糖酶酶活的测定比较(见表2)

表2 LC633P蛋鸡5%预混料中添加KDN全细胞酶木聚糖酶酶活测定结果

样品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

KDN全细胞酶+LC633P蛋鸡5%57028385.12是

KDN全细胞酶+LC633P蛋鸡5%55778383.84否

KDN全细胞酶665283100否

由表2可知，预混料LC633P蛋鸡5%添加KDN全细胞酶，在测定过程中添加6%的EDTA·2Na，使得测定的木聚糖酶活提高了12500u/g，即提高了1.3%。

2.3LC633P蛋鸡5%预混料中添加全细胞酶是否一次性稀释到位测定木聚糖酶酶活比较(见表3)

表3 LC633P蛋鸡5%预混料中添加KDN全细胞酶木聚糖酶酶活测定结果

样品酶活u/g%是否一次性稀释

KDN全细胞酶+LC633P蛋鸡5%60611691.11是

KDN全细胞酶+LC633P蛋鸡5%55778383.84否

KDN全细胞酶665283100否

由表3可知，预混料LC633P蛋鸡5%添加KDN全细胞酶，在测定过程中一次性稀释到位测定，使得测定的木聚糖酶酶活提高了48333u/g，即提高了7.27%。

2.4各种预混料中添加植酸酶后植酸酶酶活测定结果(见表4)

表4 各种预混料中添加植酸酶后测定植酸酶酶活

样品植酸酶酶活u/g%

植酸酶+LC633P蛋鸡5%393365.17

植酸酶+LC15蛋鸡5%538789.26

植酸酶+BC15肉小鸡5%549991.11

植酸酶+BC35肉大鸡5%581396.3

植酸酶+SB34猪4%468177.56

植酸酶+SB44P猪4%558092.46

植酸酶+LH600猪4%582096.43

植酸酶+EV24鸡4%591197.94

植酸酶+BV14肉鸡0.4%564693.55

植酸酶+DV鸭0.4%571594.7

植酸酶+BV肉鸡0.4%558392.51

植酸酶5000u/g6035100

由表4测定酶活结果可知，大多数预混料中植酸酶活实际测定值都集中在4681～5911u/g之间，实际测定酶活表明仍有2.06～22.44%的酶活没有测定出来。

2.5在LC633P蛋鸡5%预混料中添加植酸酶酶稀释缓冲液中是否添加EDTA·2Na对植酸酶酶活的测定比较(见表5)

表5 LC633P蛋鸡5%预混料中添加植酸酶后植酸酶酶活测定结果

样品酶活u/g%是否添加EDTA·2Na

植酸酶+LC633P蛋鸡5%516293.06是

植酸酶+LC633P蛋鸡5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表5可知，预混料LC633P蛋鸡5%添加植酸酶，在测定过程中添加6%的EDTA·2Na，使得测定的植酸酶酶活提高了901u/g，即提高了16.26%。

2.6在LC633P蛋鸡5%预混料中添加植酸酶是否一次性稀释测定植酸酶酶活比较(见表6)

表6 LC633P蛋鸡5%预混料中添加植酸酶后植酸酶酶活测定结果

样品酶活u/g%是否一次性稀释

植酸酶+LC633P蛋鸡5%536696.71是

植酸酶+LC633P蛋鸡5%426176.8否

植酸酶5000u/g5548100否

由表3可知，预混料LC633P蛋鸡5%添加植酸酶，在测定过程中一次性稀释到位测定，使得测定的植酸酶酶活提高了1105u/g，即提高了19.91%。

3.小结与讨论

预混料中添加KDN全细胞酶和植酸酶后对预混料中木聚糖酶酶活、植酸酶酶活测定结果表明，测定过程中缓冲液添加6%的EDTA·2Na、一次性稀释到位直接测定可以明显提高预混料中木聚糖酶或植酸酶酶活的测定值，可以更为客观的反映预混料中添加酶制剂的酶活含量。选用LC633P蛋鸡5%预混料作为实验材料，是由于该预混料测得的木聚糖酶酶活、植酸酶酶活最低，选择此预混料进行酶活测定方法的优化，更能说明添加6% EDTA·2Na或一次性稀释到位可以明显提高酶活在预混料中的酶活实测值这个现象。添加6% EDTA·2Na使预混料中酶活实测值得到提高，原因是预混料中的一些重金属离子与EDTA生成螯合物，减少了对酶蛋白的毒性影响;一次性稀释到位法避开了分步稀释法中的第一步稀释中重金属离子浓度太高对酶的毒性失活作用，可以提高预混料中酶活的测定值，而且添加酶进入饲料进入消化道也是一种一次性稀释状态，因此一次性稀释到位测定酶活更加真实的反映了酶在动物消化道内的实际情况，比较其它处理办法而言，对实际生产更具有实际意义。此外，通过以上试验表明，酶制剂添加到预混料中测定酶活值变化较大，并不能说明酶制剂在预混料中失活，而是测定方法需要不断的改进和完善。本试验为预混料中检测酶活的测定方法建立提供了一种新的思路，完善了酶活测定方法。添加6% EDTA·2Na或一次性稀释到位测定预混料中的酶活，是否也可以应用到其它酶的酶活测定方法当中，有待于进一步试验和研究。

zhou7550

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