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胚胎干细胞培养标准化操作规程 6/28/01

目录

一、细胞

二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞
明胶包被
细胞传代

三、体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
体外分化方法

四、移植细胞的准备

细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。


培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液
DMEM(高糖)
马血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。

冻存细胞
冻存液
90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被
准备500ml 0.1％明胶溶液
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代
建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

1．去除培养液；
2．1×无钙镁PBS洗涤；
3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释。)37℃孵育5分钟。
4．加入ES培养基使胰酶失活；
5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；
6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；
8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）
9．建议按1：4－1：10的比率传代(ATCC)
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

体外分化
多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
时间线（总时间为27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天
培养基
EB
配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST（P104U/mlS104μg/ml

ITSFn and N3：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液
DMEM(高糖)
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
层粘连蛋白100μg/ml
纤维连接蛋白250μg/ml
碱性rhFGF, 10μg/ml
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液 溶剂，贮存液，稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
层粘连蛋白（100μg/ml）
纤维连接蛋白（250μg/ml ）
碱性rhFGF, （10μg/ml）

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备
多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：
1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行）
2．吸出多聚-L-鸟氨酸
3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5．贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步：ES培养基
在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步--ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释）
2．37℃孵育5分钟
3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更换培养基

第5步－N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
2．根据需要换液（大约每隔一天）
3．分化10～15天后固定细胞
移除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次
储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS
移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植
1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
3．离心3分钟
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
5．37℃水浴5分钟
6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7．离心2分钟
8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．离心2次
11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）
4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，
5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟
6．离心2分钟
7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
8．重复一次
9．离心2分钟
10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。

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分子生物学技术综合实验讲义


上海交通大学生命科学技术学院
2004年11月
说 明

本实验讲义是在接受了去年实验的成功经验和失败的教训的基础上编写的。实验的名字叫“分子生物学技术综合实验”，原来是想把它设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。但由于经费和条件的限制，还是放弃了这个念头。
实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是凝胶电泳和免疫杂交。两个部分的分量大致相当，但后一部分做起来对学生的收获可能更大些，因为很少有本科生能一个人原原本本地亲手做一做免疫印迹实验的。它的操作虽然并不复杂，但成本却很高，特别如果使用的是从公司购买的抗体的话。
实验讲义在文字上，主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本，蛋白质部分主要是根据自己平日工作的积累。
希望同学们能够珍惜这次机会，认真地做实验，真正地掌握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。千万不要忽视实验技能的培养和提高，生物学的成就毕竟主要是通过实验干出来的。

上海交大生命学院 孙群
2004年11月

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．小型高速离心机
2．恒温摇床
3．恒温箱
4．-20℃冰箱
5．恒温水浴器
(二)材料
1．氨苄青霉素
2．大肠杆菌DH5a
3．pUC19
4．1.5mL 离心管
5．枪头、枪
6．试管、培养皿
(三)试剂
1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）
2．LB培养液
在950mL去离子水中加入：
胰蛋白胨 (tryptone) 10g
酵母提取物 (yeast extract) 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。

[实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：
1．新鲜制备的或-20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。
3．冰上放置30分钟。
4．42℃水浴热激60秒。
5．冰上放置2分钟。
6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。
7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

[实验结果]
经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。
实验二 质粒DNA的提取

[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．恒温摇床
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
(二)材料
1．带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
2．1.5mL 离心管
3．枪头、枪
(三)试剂
质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

试剂盒的参考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
Solution III
5mo1／L 醋酸钾 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE缓冲液
10mmo1／L Tris·HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

[实验步骤]
(一)提取质粒
将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)
(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。



附：试剂盒说明书

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1
上海申能博彩生物科技有限公司
bbst＠shl63．net www．biocolors.com

试剂盒组成：

组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次）
Solution I(a) 5m1 10m1 25m1
Solution II(b) 10m1 20m1 50ml
Solution lll 20m1 50m1 2x50m1
Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1
TE(d) 5m1 10m1 40m1
3S Column 50支 100支 250支
Co11ection tube 50支 100支 250根
说明书 1份 1份 l份

注：
a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：
● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)

1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；
质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。


实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温培养箱
2．琼脂糖凝胶电泳系统
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
5．紫外核酸检测仪
(二)材料
1．pQE-31和pUC18-CAT质粒
(三)试剂
1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)
配1000mL 50xTAE：
Tris 242 g
冰醋酸 57 mL
0.5mol／L EDTA 200 mL
pH 8.0
2．凝胶加样缓冲液(6x)
溴酚蓝 0.25％
蔗糖 40％
3．琼脂糖
4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL
5．250bp DNA 分子量标准

[实验步骤]
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％ 线性DNA的有效分离范围／kb
0.3 5—60
0.6 1—20
O.7 0.8—10
O.9 0.5—7
1.2 0.4—6
1.5 0.2—4
2.0 0.1—3

实验用1.2％琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。
2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。
5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
(三)加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
(四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。
2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。
(五)染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。

[实验结果]
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。

实验四 DNA重组

[实验原理]
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
(二)材料
1． 氨苄青霉素
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6． 培养皿
7． 接种针
8． 金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）

[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3．反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。
4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1．用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

[实验结果]
过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。

附：试剂盒说明书

3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit
上海申能博彩生物科技有限公司
WWW．biocolor.com
试剂盒组成：

试剂盒组成 K131(50次) K132(100次) K133(250次)
3S Co1umn Collection Tube Solution SN Solution B Wash Solution(a) TE 说明书 50支 50支 30m1 10m1 22m1 10m1 1份 100支 100支 60m1 10m1 2X 22m1 10m1 1份 250支 250支 150m1 25m1 5X 22m1 10m1 1份
注：
(a)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次
使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。
(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脱，测序样品请用水洗脱。
试剂盒DNA回收率：
3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60％以上。

主要用途：
(a)TBE或TAE Agarose胶中回收DNA片段。
(b)从溶液中回收和浓缩DNA，去除反应体系中的蛋白质。

操作步骤
从Agarose胶中回收DNA：
1．用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短。
2．按每100mg Agarose胶加入400ml Solution SN，置于55-65℃水浴中5分钟，中途混匀，至胶完全融化。胶融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B，混匀。注意；高浓度的胶(1．5-2％)，每100mg胶加入500ml Solution SN，加热融胶的时间延长到15分钟，以保证胶全部融化，胶融化后加入100ml SolutionB，混匀。
3．将3S柱放入2m1收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温放置2分钟。盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温离心(10，000rpm)1分钟。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600ml Wash Solution，室温离心(10，000rpm)1分钟。
5．重复步骤4一次。
6．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，室温高速离心(10000 rpm)2分钟。
7．将3S柱放入一根新的1．5m1离心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室温放置2分钟。注意：提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。也可以用预热的TE或水洗脱。
8．盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，10，000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

从溶液中回收和浓缩DNA：
1．根据溶液的体积和所要回收DNA的含量，加入5倍体积的Solution SN。如果溶液的体积不足100ml，加TE补足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混匀；
2．以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。

实验五 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查

一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。操作方法如下：

1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。
3. 在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50mL 灭菌的10mmo1／L EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4. 每管加50mL配制的0.2mo1／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。
5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。
6. 加3mL 2mol／L KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。
7. 冰浴5分钟。
8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。
9. 制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50mL上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。
10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。
11. 紫外灯下观察、拍照。


通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。重组子应该可以切下预期大小的插入片段。

实验六 GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提

[实验原理]
把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。

[仪器、试剂和材料]
1、pGLO转化的大肠杆菌
2、LB培养液
3、氨卞青霉素
4、L-阿拉伯糖
5、硫酸铵
6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0)
7、恒温摇床
8、小型高速离心机
9、超声波组织细胞破碎仪
10、玻璃试管，三角瓶
11、1.5mL和5mL 塑料离心管
12、“枪”，枪头

[实验操作]
1、 大肠杆菌的诱导培养：
从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2-3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L-阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜。
2、 超声破碎抽提：
将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。
4次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在紫光灯下观察离心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然为绿色，则说明破碎不够，继续按前面方法再超声处理2次，然后再离心。如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到，说明破碎完全。
小心吸出上清液，集中放到干净的5mL离心管中，体积不要超过4mL，逐步地加入少量硫酸铵干粉，使达到饱和，8000转/分离心5分钟。将离心管取出，放紫光灯下观察，沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。将上清液倾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷冻于-20℃。

实验七 免疫双扩散检测抗GFP血清抗体

[实验原理]
在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，这叫作免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。

[仪器、试剂和材料]
1、磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
2、1.5%琼脂，PBS配置
3、兔抗GFP血清
4、GFP粗提物
5、微波炉
6、恒温培养箱
7、载玻片
8、自制打孔器
9、小塑料盒
10、针头、牙签
11、“枪”、“枪头”

[实验操作]
1、1.5%琼脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片，平放于实验台（台面要水平），将融化的琼脂趁热加在载玻片上（约加4mL），使琼脂铺满整个玻片的表面（注意勿使琼脂流出玻片之外）。令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径2-3毫米）在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4、GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
5、在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔血清，周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中铺一块滤纸，加少量水将滤纸浸湿，上面放两根牙签，将加好样的载玻片放在牙签上，盖好盒盖，放37℃温箱中过夜。

[实验结果的观察]
将载玻片从塑料盒中取出，在散射光的背景下（载玻片后方约15厘米处用手或深色物挡住）观察，或在特殊的装置上观察，在左侧的抗体孔与适当稀释的抗原孔之间可见白色的沉淀线，而右侧的对照则无。如果将载玻片放在紫光灯下观察，沉淀线会发出绿色荧光，这说明抗原-抗体复合物中含有GFP。

实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达

[实验原理]
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
pGLO是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达GFP，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS—PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western—blotting）的方法，用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。

[仪器、材料和试剂]
(一)仪器
1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．电泳仪
3．干式恒温培养器
4．微波炉

(二)材料
1． pGLO表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的

(三)试剂
1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 (已加SDS )
2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 (已加SDS)
3．10％SDS
4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。
5．10％Ap (-20℃存放)
6．2x样品缓冲液
0.5mo1／L Tris·HCl pH6.8 2mL
甘油 2mL
20％SDS 2mL
0.1％溴酚蓝 0.5mL
2—b—巯基乙醇 l.0mL
双蒸水 2.5mL
7．5x电极缓冲液
Tris 7.5g
G1y 36 g
SDS 2.5g
双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用
8．染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。
9．脱色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85


[实验步骤]
1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm的玻璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好，然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧，注意底部的U形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。
2．配制浓度为12％的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择)，配方如下：

双蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
10％ SDS 100 µL
TEMED 10 µL
10％AP 100 µL
总体积 10 mL （刚好灌制两块胶）

混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合)，室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。这时可以开始配制4％的浓缩胶，配方如下：
双蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
10％ SDS 30 µL
TEMED 5µL
10％Ap 30µL
总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶）

混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。
3．细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中，12000r/m离心3分钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×样品缓冲液，在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。
4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用2%融化的琼脂填满，否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。
5．电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保证能够导电，且电场均匀。
6．加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。
7．电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上（注意电极不要接错），然后接通电源。先将电压调到80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要，分离胶放到塑料盒中染色。
8．染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟（摇床上缓慢振荡），然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），1小时后换一次脱色液，振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。

[实验结果]
染色后的聚丙烯酰胺凝胶上可见许多大大小小的条带。比较两个大肠杆菌样品，经阿拉伯糖诱导的与未加阿拉伯糖诱导的，前者在约25kD处明显多一条带，这就是GFP所在的位置。

实验九 GFP的免疫印迹

[实验原理]
免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（Ap）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）染色，再加酶的底物显色，通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。
为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白，本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以保持GFP的天然活性，利用荧光对其进行追踪。此外，实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体，以节省费用。蛋白A是从细菌分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白，在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。同样是为了节省费用，实验中用醋酸纤维素膜（AC膜）代替硝酸纤维素膜（NC膜），这样要便宜得多，而效果却无大差别。

第一部分：GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳，除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外，其余的与SDS-PAGE几乎相同。因为要做免疫印迹，电泳结束后，凝胶不染色，而是做转移电泳。

[仪器、材料和试剂]
(一)仪器与器材
1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．电泳仪
3．微波炉
4．小型高速离心机
5．专用紫光灯（BIO-RAD公司）
6．枪，枪头，1.5mL 离心管
(二)材料
1．蛋白样品：GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀
(三)试剂
1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8
2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8
3．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。
4．10％Ap (-20℃存放)
5．2x 非变性胶样品缓冲液：
0.125 mo1／L Tris·HCl pH6.8
20％ 甘油
0.01％ 溴酚蓝
6．5x电极缓冲液
Tris 7.5g
G1y 36 g
双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用

[实验操作]
1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：
2．做胶：先配制浓度为12％的分离胶，配方如下：

双蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
TEMED 10 μL
10％AP 100 μL
总体积 10 mL （刚好灌制两块胶）

灌分离胶胶后在胶面上加水封，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），开始配制4％的浓缩胶，配方如下：

双蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
TEMED 5μL
10％Ap 30μL
总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶）

灌浓缩胶、插1mm的梳子。待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理。
3．非变性凝胶电泳蛋白样品的制作：在GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀中加2x 非变性胶样品缓冲液100微升，用枪头吹打，使沉淀溶解，将样品液转移到1.5mL离心管中，12000r/m离心3分钟，取上清液加样。
4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板"三明治"从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉，用2%融化的琼脂填满胶底的空隙，注意不要产生气泡。
5．电泳槽组装：封底后将玻璃板"三明治"凹玻璃面向内重新装到"提篮架子"上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。
6．加样：取蛋白溶液离心后的上清液加样，加成一个梯度，即每一泳道的加样量依次减半。
7．电泳：先将电压调到80V，当样品进入分离胶后，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。
8．将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，小心地用塑料牙签将凝胶从玻璃上剥离下来，使凝胶贴在事先准备好的一张比胶面略大的滤纸上。操作时要徐缓，小心不要把胶弄破。


第二部分：免疫印迹染色

[仪器、材料与试剂]
(一)仪器与器具
1．电泳仪(要求为大电流低电压)
2．电泳转移槽及转移夹
3．水平摇床
4．小塑料盒
5．镊子
6．搪瓷盘
(二)材料
1．醋酸纤维膜
2．滤纸
3．一次性塑料手套
(三)试剂
1．转移电泳缓冲液
25mmo1／L Tris，192mmo1／L 甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3
6.05gTris + 28．83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L
2．PBS贮存液(10xPBS)
0.2mo1／L 磷酸缓冲液，PH＝7.4，含8.7％ 的NaCl
3．PBS缓冲液：10xPBS贮存液用重蒸水10倍稀释
4．封闭液：PBS + 5％脱脂奶粉
5．漂洗液：PBS + 0.2％Triton X-100
6．丽春红染色液：4％三氯醋酸，1％丽春红
7．一抗：兔抗GFP血清，用PBS适稀释50-100倍
8．辣根过氧化物酶标记的蛋白A (HRP-pA)
9．DAB显色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4-7.6）中，然后加入50微升的0.5％的过氧化氢。显色液不稳定，要在临用前配制。

[实验操作]（接第一部分的实验操作8往下做）
1．将醋酸纤维素膜（AC膜）事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。
2．在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液，将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡，使完全浸透。同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。
3．将转移夹打开，置搪瓷盘中，在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵，把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上，在转移电泳缓冲液中使AC膜紧贴在凝胶上，切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。再把一张滤纸浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一块海绵。将转移夹合上，夹紧，做成“三明治”。
4．转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液，将“三明治”夹放入，使凝胶块（即黑色的一面）朝向负极，AC膜朝向正极，切勿放错方向，否则蛋白将跑到溶液中，而不是转移到膜上。
5．接通电泳仪电源，使电流达到100-150mA，电泳转移过夜。
6．转移电泳完毕，将转移“三明治”夹从转移电泳槽中取出，将夹子打开，用镊子捏住AC膜的一角，将AC膜有蛋白的一面朝上放在一块干净的滤纸上。于暗处在紫光灯下，仔细观察发绿色荧光的条带的位置，用铅笔点一些点子，标出它。
7．将AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中，加丽春红染液10-20mL，染色3分钟，用蒸馏水轻轻漂洗数次至背景红色消失。这时应该可以看到转移到膜上的蛋白条带。
8．倾去漂洗的蒸馏水，在小塑料盒中加入封闭液10mL，室温下于脱色摇床上缓慢振荡1小时。
9．倒出封闭液（弃去），用PBS洗一次，加PBS稀释的一抗溶液5mL，室温下缓慢振动3小时或过夜。
10．取出AC膜，用PBS漂洗液洗3次，每次5分钟(手摇或脱色摇床上振荡)。
11．放入HRP标记的蛋白A溶液中，在室温下于脱色摇床上缓慢振动3小时或更长时间。
12．取出AC膜，用漂洗液洗涤，方法同10。
13．加入DAB显色液5mL，轻轻晃动，显色数分钟或更长的时间，直到黄褐色的条带清晰可见，加入蒸馏水漂洗几次，洗去显色液，终止反应。注意主要的显色条带是否与事先用铅笔标记的位置相重合。
14. 将AC膜夹在两张干滤纸中间，将水分略微吸干，然后扫描或拍照，记录实验结果。



实验十 非变性条件下GFP的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳

[实验原理]
制备电泳与普通的分析电泳在原理上没有什么不同，只是用的凝胶厚些、加的样品量大些罢了。因为制备电泳的胶厚，电泳时有个散热问题，电泳后还有把所要分离的蛋白从胶中洗脱下来的问题。为了提高制备电泳的效率，有些公司（如BIO-RAD）生产了专为制备电泳设计的电泳槽。我们的实验用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备GFP，在整个的电泳过程中GFP始终维持其天然活性。电泳结束后，不用染色处理，在紫光照射下可以很容易地将发绿色荧光的GFP条带从凝胶上切下来。

[实验操作]
1、用1.5毫米夹条的玻璃板做胶，分离胶的浓度仍为12%，注意用不含SDS的非变性系统缓冲液配胶，配浓缩胶时也同样。
2、做浓缩胶时不加梳子，而是做分离胶那样用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面。
3、制备电泳的蛋白样品与前次免疫印迹的相同，用非变性的样品缓冲液做样，样品不加热处理。上样前要充分离心(1.5mL离心管，12000rpm，5分钟），勿使所加样品中含有沉淀。
4、上样量0.2-0.4mL，上样后要使样品的高度在整个浓缩胶面上均匀分布。
5、在样品完全走进浓缩胶前电流不要调得过大，以免样品发热，产生明显的对流。待样品完全走进浓缩胶后可以加高电压，但不要超过150V，以防过热。
6、电泳结束后，取下并打开玻璃板“三明治”，在紫光灯下用刀片将发绿色荧光的条带从胶上切下，切成小段，放于干净的1.5mL离心管中，冷冻保存。

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DNA 指纹技术（DNA fingerprinting）

一一、 主要仪器与试剂
仪器：水浴锅、恒温摇床、暗合、X光片、同位素操作屏蔽设备、暗室洗片设备、尼龙膜、吸水纸
试剂：1、ACD液的配制： 柠檬酸 0.48 g
柠檬酸钠 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至100ml，高压灭菌
2、SET的配制：1 M Tris-Hcl (PH8.0) 2.5 ml
250 mM EDTA-Na2 (PH8.0) 25ml
5 M Nacl 5ml
加入ddH2O至250ml , 高压灭菌
3、蛋白酶K：10mg蛋白酶K + 1ml ddH2O, 充分溶解后，-20℃保存
4、20%SDS： SDS 5g 加入ddH2O 定容至50ml
5、1M Tris-Hcl (PH8.0)：
121.0g Tris + ddH2O 至800ml溶解，用纯的HCL调节PH 8.0 定容1 L。（灭菌）
6、0.5 M EDTA-Na2 (PH8.0)
EDTA-Na2 186.1g +800 ml ddH2O于磁力搅拌器上溶解，用NaOH调节PH 8.0，定容1 L.。（灭菌）
7、5M Nacl溶液
29.22g Nacl +80 ml ddH2O 溶解后，定容100ml。（灭菌）
8、5×TBE缓冲液
54g Tris + 27.5g 硼酸+20 ml 0.5M EDTA (PH8.0)+800ml ddH20 , 定容 1 L。
9、设计的内切酶（含有各种的Buffer）
10、琼脂糖、HCL、NaOH
11、50*TAE
242g Tris + 700ml ddH2O 溶解，+100ml 0.5M EDTA(PH8.0)+57.1的冰醋酸；定容1L。
12、10*BPB
0.2M EDTA，20%聚蔗糖，0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚兰
13、变性液
1.5mol/L Nacl ,0.5mol/L NaOH
14、杂交液
100g SDS + 50ml蒸馏水加热溶解厚后，
在加入10ml 10*blotto(至终浓度为1*blotto ,1%脱脂牛奶，0.02%叠氮钠)，
5ml 20*SSC(至终浓度为 1*SSC) +35ml蒸馏水
15、20*SSC
175.3gNacl + 88.2g柠檬酸钠 + 800ml ddH2O,用浓的NaOH调节PH7.0之后，定容1L。灭菌


二、实验步骤
1、基因组DNA的制备（方法同RAPD技术）
2、基因组DNA用限制性内切酶酶切（反应条件可根据试剂要求变化）
（1） 在一个新的干净的1.5ml的离心管内加入以下的成分：8~10 ug DNA , 1ul 酶（10U以上），2ul 10*Buffer ,2ul 40 mmol/L 三氯亚精胺，补加灭菌的双蒸水至20ul。
（2） 在内切酶的适宜温度下反应足够的时间。
（3） 取出酶切的样品于4℃下保存备用。
3、制备琼脂糖凝胶和酶切产品的电泳
（1）使用TAE缓冲液制备0.8%的琼脂糖凝胶（大胶用，2cm厚度，约用300ml）。
（2）向酶切样品加入1/10体积的10*BPB，充分混匀。（上孔加样，记住加入DNA Marker）
（3） 加样（5~10min）后，20V恒压电泳48h左右。
4、进行Southern转移
(1) 电泳完成后，将凝胶连同作胶板一起放入一个 方型的塑料盒内，倒入500ml的0.2mol/LHcl处理25~30min.间断性摇动混匀（5min/次）。
（2）倒掉稀盐酸溶液，加入灭菌的双蒸水洗涤一下凝胶，倒掉水；加入500ml的变性液浸泡30min, 间断的摇动。
(3)倒掉变性液，加入500ml 0.5倍的稀释变性液（0.75mol/L Nacl ,0.25mol/L NaOH）浸泡20min，间断的摇动。
(4)将凝胶移到一块干净的玻璃板上,切掉凝胶多余的无用部分,将已经裁剪好的尼龙膜平铺在凝胶表面(先在0.5的变性液中浸泡),用玻棒轻轻压其表面赶走气泡.
（5）将三张稍大于膜的滤纸放于膜上，每放一张就应用玻棒将其表面的气泡赶走（滤纸应先在0.5的变性液中浸泡）。
（6）将一打（约4~5cm厚的）吸水纸放在滤纸上,在将一块玻璃板放在吸水纸的上面,压紧两块玻璃板迅速翻转,并去掉胶面上的玻璃.
（7）在胶面上放置三张较凝胶大的滤纸（先于0.5倍的变性液内处理），并用玻棒轻轻的赶走气泡。（为了防止上下的滤纸相互接触，可先用保鲜膜在刚翻转时将外露的滤纸和吸水纸封住）
（8）将整个的装置用保鲜膜封好（防水分的蒸发），并压上一块玻璃板；持续转移6~8h，取出尼龙膜放在2*SSC中浸泡20min ,然后放在一张滤纸上烘干，即可备用。
5、随机引物法标记小卫星探针


6、预杂交、杂交、洗膜
（1）将预热的杂交液（60℃）倒入塑料盆中，将待杂交的膜一张张的放入杂交液。恒温（60℃）摇床震动6h左右。
（2）将标记的放射性探针于沸水中处理5~10 min以变性DNA，然后迅速取出插入冰中。
（3）将尼龙膜取出，按5*105cpm/ml的浓度加入变性的探针，缓慢的摇匀，然后将膜重新放入杂交液中，恒温（60℃）摇动15h。
（4）将膜取出放入1*ssc 溶液中室温洗涤5min，然后转入洗膜液中（1*SSC、.1%SDS）于（60℃）洗涤30min 更换洗膜液重复一次。
（5）将膜放入1*SSC于室温下洗涤5min。取出平铺于干燥的滤纸上，待倒无水珠时，用保鲜膜包好备用。
7、放射自显影（具体根据暴光盒决定）
（1）在暗室内打开X光暴光盒，加入一张增感屏，X光片放在膜上，另一张增感屏光滑面朝下放在X胶片上，盖紧盒子，放入-70℃放射自显影暴光。
（2）暴光完成后，在暗室洗片，X光片在显影液中12min，1.5%冰醋酸溶液（停显液）中10S，再装入定影液中5min，最后放入流水冲洗20min，晾干后即可分析。

牧童

谢谢版主!!!!