人工授精最佳方案的重点应放在排卵的相对时间的掌握及对公猪的有效利用

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人工授精最佳方案的重点应放在排卵的相对时间的掌握及对公猪的有效利用

华中农业大学牧医学院动物病毒室   王贵华

前言

猪场中的最佳授精方案主要是降低授精量而不降低繁殖力。当在排卵前24小时期间进行授精时，高质量精液的授精可获得好的繁殖力。然而，因为母猪排卵时间不能在24小时内预知，所以，纵使清楚这个最佳时间，但为了得到最佳授精效果，这段时间和/或排卵时间的预测还是需要改进的。有关授精的时间安排——发情周期的相对特征和繁殖力（母猪产仔率，一窝产仔数）的关系已在六十年代和七十年代就进行过研究。九十年代早期以来，超声波已应用到自然排卵母猪排卵时间的预测上。实验中，根据母猪行为和生理学方面的变化进行母猪的排卵时间安排及授精方案对受精的影响，完善了现有知识。而且，授精时间的安排，授精期间环境对授精的影响至关重要。此外，本文还提及了关于公猪出现对子宫运动作用的最新资料（Langendijk,2001），以及授精和排卵期间的最佳时期。

排卵后卵的寿命以及能引起授精的足够数量精子的寿命，决定了输卵管中成功受精的排卵相对时期（Hunter,1994）。六十年代已经开展的研究表明，发情周期中授精相对较早或较晚的母猪的受精率严重下降。（Hancock和Hoveu,1962），而且母猪产仔率和一窝产仔数下降亦很大。（Willemse和Boender，1967）。从这些实验看出，因为排卵时间随发情周期变化很大，因此对精子寿命和发情周期是很难下结论的（Soede和Kemp，1997）。所以在这些实验中，通常使用人工排卵的小母猪来研究受精过程（例如，Dziuk,1970;Hunter,1967;Hunter,1981;Hunter et al.,1987）。这些实验都表明：精液的运输、精子细胞的获能和精液量的多少均对授精至关重要。

近几年来，有关自然排卵的相对受精机会的研究已有报道。研究发现，在一些母猪中，当在排卵前40小时到排卵后16小时之间进行授精（30亿精子细胞用量）时，受精效果理想（Soede et al.,1995a）。然而，要使多数母猪都取得理想的受精结果，授精则须在排卵前12小时（Waberski et al.,1994a）或24小时期间（Waberski et al,1994b;Soede et al.,1995ab;Steverink et al.,1997）进行，见图1。

以30亿精子细胞做为一个授精剂量进行授精后，受精率因排卵的可变间隔可分别为0%、1-20%、21-40%、41-60%、61-80%、81-99%和100%（摘自Soede et al.,1995ab和Steverink et al.,1997）。从以上结论可看出，当在排卵之前进行授精，受精结果最佳。在排卵前0~24小时内，多数母猪受精率达100%，在这个时段之外，部分受精的母猪的百分比和没有受精的母猪的百分比均有所升高。基于母猪产仔率和一窝产仔数，授精和受精之间的最佳间隔可以更长一些，可在排卵前28小时至排卵后4小时之间进行（Nissen et al.，1997）。而事实上大约24小时的间隔会导致受精率下降，这意味着多数母猪中，大多数精子的受精寿命被限制在24小时内。在排卵之前进行授精会导致受精率的下降，这就是说，卵母细胞的受精寿命大约和精子与之结合并到达受精位置的时间相近似。然而，即使是在最佳时期内，仍有部分母猪受精不理想，甚至没有受精（见图1）。

近来，有关何时授精才能获得最佳受精结果这一问题，已做了大量的试验。下列各项影响因素已得到调查：

1．贮存过程中精子老化；虽然授精时精子超过38小时并不影响结果（Soede et al.,1995），但使用老化精液缩短了授精的最佳时期（Waberski et al., 1994b）。

2．稀释液；精液贮藏对授精最佳时间的负影响主要取决于采用的稀释液（Waberski et al.,1994b）。

3．精液量；精子是从10亿到60亿几乎不能影响授精的最佳时期。

4．冷冻精液；使用冷冻精液时，要在授精最佳时期排卵前0~4小时进行。

5．精液回流；只有在精子量少（10亿）授精和回流超过20ml（共80ml时）授精时的精液回流，才会影响受精。授精后的精液回流对受精没有影响（Steverink et al.,1998）。

总之，从上面可以看出，是到达输卵管的精子数量和/或质量降低的因素，缩短了最佳受精的授精时间。可以推断，在排卵前0-24小时进行授精，使用高质、最多2日龄的精子，可以使受精率大为提高。但奇怪的是，即使授精量加倍，也很难获得理想的效果。

近来的实验表明，完全可以提高精子运动和/或存活率，其可能性如下：

1．提高精子质量？

除了运动性，精子的一些体外因素也与体内受精结果有关（Colenbrander,2000）。近来，研究发现，（公牛和公猪）精子细胞有与透明带或透明带蛋白结合的能力。Harkema et al (1998)发现，经3小时培养，血管内液中与透明带蛋白结合的公猪精子细胞（可能是获能精子细胞）的比例达到最高峰。高峰的水平随公猪个体而变化极大（Harkema et al,2002）。四头公猪的精子经3小时培养后，分别有31%、40%、45%和53%的精子与透明带蛋白结合力增强，体内卵母细胞受精率（排卵后用5亿精子细胞立即授精）平均为77%、82%、87%和94%，有40%、62%、67%和83%的母猪的卵细胞与精子的受精率达100%。（Harkema et al,2002）。因此，公猪精子细胞体外获能的差别与体内受精结果密切相关。这种正相关性是否在排卵前而非排卵后授精时发生值得探讨。如果体外透明带结合率与体内精子细胞受精寿命存在相关的话，公猪的平均受精率可能相近，这将使之不能成为公猪选种的有效工具。然而若将不同公猪精子进行选择性混合可能有助于受精。

2．减少精子细胞吞噬量？

精子授精后1小时内不能到达输卵管，主要是由于细胞的吞噬作用。Rozeboom et al (1999)发现授精过程中精浆的掺入引起白细胞流入子宫腔的比率改变。资料进一步表明，授精方式影响白细胞对精子的吞噬作用。（Woelders,2001）。因此，对白细胞的流入量和其对精子细胞的吞噬进行调控可以改变到达受精部位的精子数和受精比率。

3．授精过程：进行子宫的（深部位）授精？

特别是在精液昂贵的时候，由于精子数量较少，因此授精过程非常重要。（例如，有特定遗传基因组成的公猪精液）。在西班牙（Martinez et al.,2001）和德国（Rath et al.,1999）实验室已经研究出了子宫深部位授精程序。用5千万精子进行授精，成功引起母猪怀孕。农场试验中，在子宫头盖部进行授精（非子宫深部）。这表明此项技术允许精液量减少到10亿（Waston 2001）。然而，目前的子宫授精技术的弱点在于仅对老的同等母猪的限制性使用和缺乏技术熟练的授精人员不易掌握。

4．母猪的特征？

品种不同，卵母细胞繁殖寿命也不同（Kemp和Soede,1997）。但是，对可能影响母猪的诸如获能比率、子宫的运动、精液的传送或精液在生殖区的生存等方面的因素仍知之甚少。然而，最近已有资料报道影响子宫运动性的因素（见下文）。

总之，在母猪的生殖腔中，进一步提高精子的传送和生存能力有诸多可能性。这些进步将使授精量减少或不太理想条件下（精液老化，授精人员不熟练）提高受精率。在这方面，授精时公猪出现显得非常重要（见下文）。

排卵时间的预测标准：

排卵基本上开始于发情后35到45小时之间（公猪出现后的静立反应）。然而，母猪间的差异是很大的。比如在10~85小时之间（Weitze et al.,1994）或10~58小时之间（Soede et al.,1995a），即使有时没发现差别。另外阴道的温度和阴道内粘液润滑性也不是排卵时间的理想预测标准（Soede et al.,1997;Stokhof et al.,1996）。

九十年代，在德国、荷兰、瑞士、丹麦的调查中，一般排卵时间安排（发情比例）在64~72%之间变动（Soede和Kemp,1997）。发情持续时间（也就是母猪在见到公猪后发生的静立反应的一段时间）在排卵时间的50-60%之间变动。因此，发情持续时间看起来是发情时对排卵时间的最好估计指标。但发情持续时间极易发生改变，对排卵时间只能提供回顾性的估计指标。所以，研究应致力于寻求其它用于排卵时间安排的预期估计指标。

在发情期间，母猪对所采取的促进发情的刺激所作出的反应先增强后降低（Willemse和Boender,1967）。这就是说，发情的早晚期，母猪对强烈刺激（如交配区探查或公猪的紧密接触）作出反应。当处于发情中期时，其对较低强度的刺激也能作出反应。（如公猪不在时进行压背法）。在发情期间，通过不同强度的刺激，可以区分出不同的敏感期（如公猪不在时对压背法的敏感性，公猪与其以栅栏相隔时对压背法的敏感性，或进行交配区探查时对压背法的敏感性）。Langendijk et al.,（2000b）进行了发情探查时不同强度的刺激可否区分更多的反应时期和是否能用于更精确的排卵预测两方面的研究，但结果并不理想。大多数母猪在发情期对低强度刺激根本不表现出静立反应。因此，不能区分发情期不同的反应时期。而且，即使发情时母猪表现出更多的反应时期，这些时期也与排卵时间联系甚少。

多参数（体质和行为方面）的结合对排卵时间的估计可能比单一参数效果好。Langendijk et al （1999b）最近进行了一次尝试，他把母猪内阴的潮红温度与发情行为特征结合起来。母猪开始发情时，阴部变红的母猪大约占60%，其一般在排卵前18小时由潮红变为粉红，并且始终在排卵前36小时和排卵后2小时之间变动。在研究中，虽然没有检测到激素，但阴部由潮红到粉红的变化可能与发情变化有关。如果这些结果正确，那么那些在发情开始内阴户就潮红的母猪没有必要在阴部潮红消退前进行授精，这样精子就得到合理的利用。

若排卵时间取得最终的预测，那么就可以用简单的方式来控制催乳激素的上升或激素结合物的下降。但对猪来说，这是不切实际的。不久的将来，母猪发情周期的推测势必应着眼于排卵时间的预测。

建立更有效的授精方案：

发情行为的变化以及相关的排卵时间的低预测性使得在排卵前最佳时期母猪的一次性授精更为困难。因此，大多数母猪在发情期间要重复多次授精。目前的问题是重复授精是否应在12~24小时之间进行。Lemberson和Safranski（2000）结合每天1~2次发情检查的结果对不同授精计划做过经济上的比较。在他们的模型中，怀孕的几率大于90%（排卵期间进行授精），而在排卵前24小时和排卵后6小时进行授精时，几率降低到62%，发情后40±12h，发生排卵，从断奶到排卵的时间在136±18h左右。应用这些参数，在12小时期间进行授精，经济回报最高。在发情后12、24和36小时，每天进行2次发情检查，在发情后0、12、24和36小时，每天进行一次检查。这些都是在排卵前的12小时内进行授精所见到的受精率逻辑上的结果（相对较低）。德国猪场的调查结果表明，每12小时进行一次授精的畜群，其繁殖力并不比每24小时授精一次的畜群好。（VFV，1999）。相似的是，Castagna et al.,（2001）和Thorup（2001）也从他们的试验中得出结论，认为，每隔12小时和24小时进行授精，其繁殖力相近。后来的结果比以前提及的授精试验的结果（Waberski et al.,1994b;Soede et al.,1995；Nissen et al.,1996;Steverink et al.,1997）更清楚反映了每24小时进行授精是充分的。可是，诸如技术不熟的授精人员（Flowers,1994）或精子老化（Waberski et al,1997）等因素可能会缩短授精间隔时间。

过频的授精不仅浪费精子、劳动力和金钱，还有很多负面影响。Rozeboom et al（1997）在发情前后进行再次授精降低了母猪产仔率和每窝产仔数。De Winter et al.，（1992）认为在发情前后进行授精，其子宫受感染机会远大于发情早期和中期。这种现象与发情率有关，影响血流量和白细胞汇集以及子宫的收缩。

因此，过度集中的授精措施，会导致繁殖力下降，这与发情前授精引发感染有关。

恰当的运用发情周期

因为排卵较为固定的发生在发情的2/3时期，因此，发情周期的推断既是排卵的间接推断，又是授精最佳时间的推断。可是发情周期变化异常，受多方面因素的影响，例如，畜舍的条件，紧张程度，季节，平等性，基因背景等（Soede和Kemp,1997）。不过在一定范围内，发情周期的推测是可能的。首先，虽然不同的猪场平均发情周期变化很大（31~65小时），但对同一猪厂，月与月之间是一致的（Steverink et al.,1999a）。这表明，发情期授精的最佳时间因猪场的不同而有变化。再次，发情周期与断奶—发情间隔（WOI）密切相关。（Rojkittikhun et al.,1992,Weitze et al.,1994;Kemp和Soede,1996）。通常WOI短的（3-4天）母猪发情周期长。这与排卵时间提前有关（Weitze et al 1994;Kemp和Soede,1996）。Steverink et al（1999a）发现在54家猪场中，有43家WOI和发情周期的关系非常密切，约占80%。因此，在多数猪场，WOI为6天的母猪应在发情刚刚开始后不久就进行授精，以确保在排卵之前进行初次授精。表1阐述了平均发情周期不同的两家猪场，其发情周期与最佳授精时间的关系（Steverink et al 1999b）。这些数据均来自猪授精方案模型（PIGSIS；Steverink 1999）。模型证实了初次授精时间很容易太晚，特别是在发情周期短，母猪WOI为5-6天的猪场。初次授精过早并不是个大问题，可以再次授精，但应避免在发情过后授精。因此，为了深入了解授精方案的有效度（以及发情检查的质量），场主们应建立发情周期表，还应把WOI对发情周期的影响考虑在内，以便对母猪个体授精时间安排的最佳化进行检测。

表1.  对一个平均发情周期为36-60小时的猪场，与排卵有关的初次授精的时间安排，用PIGSIS模拟。在两个猪场，在发情开始后24小时进行授精，每24小时，WOI就上升，同时伴随着发情周期下降6小时。

WOI(天)

	4	5	6
母猪（%）	17.5	32.8	23.3
猪场发情周期：36小时
过早（%）	0	0	0
合适（%）	55	37	21
太晚（%）	45	63	79
猪场发情周期：60小时
过早（%）	21	12	7
合适（%）	66	68	68
太迟（%）	14	20	25

1．过早：发情前超过24小时，太晚：发情后。

2．PIGSIS：PIG Simulation model for Insemination Strategies (Steverink,1999)。

定时人工授精：

   为了提高排卵时间的预测准确性以及定时人工授精的可行性，可采用异种激素（eCG,hCG或GnRH）。但是否成功主要取决于管理措施（Brussow et al.,1996）。激素的应用可能掩盖了管理上的不善，而且耗费大，在不久的将来，一些国家（欧盟）会相继取缔促排卵激素的使用。

授精时公猪的出现可刺激子宫的收缩：

除了授精时间，授精条件对受精成功与否也至关重要，这与外界对子宫收缩的影响有关。最近报道了授精时公猪出现对子宫收缩的影响。

交配中，精子经子宫颈内输精，通过双子宫角到达输卵管。（Viring,1980）。特别当授精时间不太理想时（例如，排卵前后时间太长），精子快速运动到子宫输卵管结合部就显得十分重要。子宫肌收缩就具有将精子细胞从子宫体转运到输卵管的功能。因此，子宫收缩有助于受精成功。图2是关于一头典型母猪在繁殖循环的不同阶段子宫收缩运动的情况。

同大多数哺乳动物一样，母猪在发情期子宫肌收缩加强（图3，Langendijk,et al.,2001a）。虽然在Langendijk et al(2002a)研究中，所有母猪在发情中子宫收缩加剧，但母猪个体间的差异是存在的。收缩频率在6-40h-1之间，收缩幅度在16-57mmHg之间变动。这些不同在发情斯持续存在。例如，发情前几天中，子宫运动较差的母猪，因为精子运动不佳而致使受精率降低。从Soede（1993）的文章中可以看出，授精时公猪的刺激，可以影响繁殖过程，例如精子运动进而影响受精，除外界的刺激（例如嗅觉和触觉刺激），内部刺激（精浆或其组成成分）也同样重要。本文仅讨论外界公猪刺激对母猪受精的影响。有关精浆成分或精子对受精的影响可参见Laus（1990）和Waberski（1997）的文章。

公猪刺激促进催产素的急剧释放，从而影响子宫收缩运动。催产素可刺激平滑肌，子宫肌对催产素敏感。发情中，刺激引起催产素释放量减少（Sheldrick和Flint,1985）。Langendijk(2001)研究了母猪发情期间，不同公猪的刺激对催产素释放的影响。在他们的研究中，分别比较了压背法，公猪外激素喷洒与压背法相结合和公猪在场压背法三种方法。

不管是否使用公猪外激素喷洒，压背法对催产素的释放毫无影响，但公猪的刺激可引起催产素急剧释放（Langendijk,2001）。自Mattioli et al（1986）发现用公猪外激素喷洒可引起催产素释放以来，其可行性就从未被怀疑过。Mathiasen（2001）在试验中发现，尽管公猪与母猪仅一墙之隔，但若仅靠压背法，仍不能促进催产素释放。他进一步指出，再用与公猪邻舍的母猪作研究，人工刺激（压背法结合腹股沟及沟下区刺激）可以促进催产素的释放，但低强度的刺激（较少刺激）对催产素释放作用并不明显。Langendijk（2001）也研究了发情期间，不同公猪刺激对子宫收缩运动的影响。公猪的出现和触觉刺激仅仅引起收缩频率和幅度的轻微增强。子宫自发收缩运动较弱（50%母猪收缩频率小于26h-1），同触觉刺激和外激素刺激相比，公猪的出现明显增强了子宫收缩频率(<0.05)。因此可以认为授精时，公猪出现可以使未接触刺激前运动较差的子宫收缩加强。

人工授精能促进子宫收缩吗？Claus和Schams（1990）发现，授精导管插入后，无催产素释放，Langendijk et al（2002a）研究发现子宫内注射生理盐水也不能促进子宫收缩。但最近研究表明，用80ml的授精量进行授精可使子宫收缩频率增加50%。在交配中用交配夹模拟刺激母猪肋部，也不能促进子宫收缩。在子宫颈内有规律地移动导管5分钟，也同样不能促进子宫收缩。总之，资料表明，授精时公猪出现对子宫收缩较差的母猪来说，可以起到积极的作用。压背法，交配夹模拟法或压背外加公猪外激素喷洒均不如公猪出现效果好。因此，用公猪刺激母猪是明智的选择。

表2.  授精（40ml，5亿精子量）前10分钟，40ml盐水加1mg前列腺素进行宫内注射对精液回流量和受精结果的影响。（引自Langendijk et al 2002b）

		盐水（n=16）	前列腺素（n=18）
回流量1	无	11(69%)	3(17%)
	少量	3(19%)	9(50%)
	大量	2(13%)	6(33%)
平均受精率		81a(0~100)	21b(0~100)
精子平均进入量		2.1a(1~21)	0~8b(1~19)

  1 动物回流类型的分布因处理方法不同而存在差别（P<0.05）

ab P<0.05

除了催产素，前列腺素也可刺激子宫肌运动。田间试验中，特别是当条件不太理想时，例如授精人员操作不熟练（Flowers,1995）或精液老化（Flowers,1996）或夏季不育时（Pena et al 1998a,b），授精时注射催产素或前列腺素，可提高繁殖力（Levis,2000）。

但子宫收缩刺激过度也会降低繁殖力（Langendijk et al 2000b，见表2）试验中，用40ml盐水或外加1mg前列腺素的40ml盐水在授精（40ml，5亿精子量）前10分钟进行宫内注射。排卵用促性腺激素释放激素（断奶后85小时，50ug）计算时间，在预期排卵（一般为促性腺激素释放激素注射后40小时）前20小时进行授精。表2体现了对精液回流和受精结果的影响。前列腺素对子宫收缩作用出现的早，但目前发现其致使回流量增加，从而降低了受精率。显然在不过分影响精子运动和受精结果的基础上控制了宫收缩的刺激是可行的。研究发现，前列腺素对所有母猪都有子宫收缩促进作用，而与其自发的子宫运动无关（Langendijk,et al 2002a），但催产素（注射（5IU）或公猪出现）对自发运动较差的母猪特别有促进作用。因此，只要刺激量不过度，对子宫收缩还是有所帮助的。在这方面，公猪出现和低水平催产素刺激是促进子宫收缩的安全途径。

结束语

有效的授精方案（减少发情期授精次数）的制定一方面取决于授精劳动力、授精量或公猪的消耗上，另一方面取决于发情检查的劳动力消耗。各消耗间的平衡可以改变，例如冷冻精子的应用、或具有特殊基因组成的精子的应用，可能要求更有效的授精方案。因此，科研主要集中于最佳授精时期的范围和排卵时间的预测上，以及精子细胞到达受精部位的有效传送上。

从文中可以看出，公猪在发情检查上的应用以及授精时公猪刺激母猪是明智之举。总的来说，若仅用公猪刺激器具（压背法或公猪外激素喷洒），其效果比公猪亲临现场要差。公猪的刺激效果也可能因个体间的差异而略有不同。

许多事实证明了母猪发情期间公猪出现的作用（Soede和Kemp，1997）。至少几月龄大小的公猪可以引起小母猪的发情（Kirkwood和Hughes，1980）。在行为方面，公猪比母猪更主动，热情。Turner et al（1996）发现，公猪的性行为水平不影响对切除卵巢的小母猪进行压背法诱导发情检测的效果。公猪性冲动可以用交配试验中的交配次数和交配前的反应时间来计算。那么，人们也许会问这个参量是否是发情检测中公猪选择的一个确切的指标？这还有待于进一步的研究。

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这就是有经验的人所为了！
不过现在都是电子监察

老乐

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