酶联免疫法检测盐酸克伦特罗的探讨

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　　酶联免疫法检测盐酸克伦特罗的探讨

　　北京市饲料监察所 贾 涛

　　摘要：盐酸克伦特罗酶联免疫反应测试盒适用于尿样、组织和饲料等样品中克伦特罗残留的定量检测。克伦特罗作为一种主要的β-兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中，用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。在畜禽产品中过量残留会对消费者造成危害，因此被禁止在畜禽养殖中使用。与传统的HPLC或GC-MS方法相比，酶联免疫方法具有操作简便、灵敏度高、成本低的优点。试剂盒方法的特点包括：a.试剂盒的提取方法能达到95%以上的回收率，可以不需用有机溶剂并在10～30min之内完成提取过程。b.高灵敏度;低检测下限。c.检测过程只需不到2小时。d.高重复性。经过试验研究，酶联免疫反应测试盒在检测盐酸克伦特罗时，相关系数(r值)可达到0.99以上，最低检测限可达到0.05ppb。
　　关健词：酶联免疫 检测 盐酸克伦特罗 探讨
　　Study of ELISA method test clenbuterol
　　Beijing Supervision Institute of Feed Jiatao
　　Abstract
　　Clenbuterol ELISA Kit is a competitive enzyme immunoassay for the quantitative analysis of clenbuterol and other related β-agonists in animal tissue,meat,animal feed and urine.Clenbuterol is one of major β-agonists illegally used in livestock production.It can improve the meat/fat ratio in fattened animals and accelerate livestock growth. Therefore,excess clenbuterol residues in livestock products may lead to health risks for consumers.This has led to a prohibition of clenbuterol use in food production. The amount of clenbuterol residues can be determined by methods such as HPLC or GC-MS.However,these traditional methods usually require very expensive preparation procedures.Alternatively,enzyme immunoassay (ELISA) can be used as a screening system,which is simple,rapid,sensitive and cost-effective compared with traditional methods.The unique features of the kit are: a.Rapid(10～30minutes),and organic reagent-free extraction method for various samples with high recovery over 95%.b.High sensitivity and low detection limit.c.A quick ELISA assay (less than 2 hours regardless of number of samples.)d.High reproducibility.By research,ELISA KIT method for quantifatioc clenbuterol,LOD is 0.05ng/g,r>0.99.
　　Keywords: ELISA test clenbuterol study
　　前言：盐酸克伦特罗残留在动物组织中，人食用后会对肝、肾等内脏器官产生毒害，出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状，严重者甚至死亡。临床表现为：a. 急性中毒有心悸，面颈、四肢肌肉颤动，有手抖甚至不能站立，头晕，乏力，原有心律失常的患者更容易发生反应，心动过速，心室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置。b. 原有交感神经功能亢进的患者，如有高血压、冠心病、甲状腺功能亢进者上述症状更易发生。c. 与糖皮质激素合用可引起低血钾，从而导致心律失常。d. 反复使用会产生耐受性，对支气管扩张作用减弱及持续时间缩短。
　　虽然克伦特罗残留的毒作用为轻度的，但美国FDA研究表明，应用拟交感神经药者或对前药过敏者，对克伦特罗的反应要比正常健康个体更为严重。
　　1、毒理简介
　　克伦特罗是一种β-兴奋剂，添加于饲料中能提高几种家畜包括猪的瘦肉率。由于其在黑市可买到，克伦特罗在欧洲、美国、亚洲非法用于家畜饲料中及饮用水中。在某些国家，非法用过克伦特罗的牛组织中的残留引起人的中毒。最近报道人食用了含有克伦特罗的猪肉导致中毒。
　　盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLB)是一种平喘药的商品名，又称氨哮素、克喘素，化学名称为羟甲叔丁肾上腺素，或“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐”。中文名称有：瘦肉精;克伦特罗;盐酸克伦特罗;盐酸双氯醇胺;克喘素;氨哮素;氨必妥;氨双氯喘通;氨双氯醇胺。
　　英文名称有：Clenbuterol; Spiropent;Planipart;NAB365;4-Amino-3,5-dichloro-alpha-[((1,1-dimethylethyl)amino)methyl]benzenemethanol;CAS号：37148-27-9。分子式：C12-H18-Cl2-N2-O。
　　理化特性：白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。
　　毒理简介：克伦特罗能激动β2-受体，对心脏有兴奋作用，对支气管平滑肌有较强而持久的扩张作用，口服后较易经胃肠道吸收。
　　该药物可选择性地作用于肾上腺素受体，是一种强效激动剂，可引起交感神经兴奋，在药物剂量下，具有松弛气管平滑肌作用，用于治疗支气管炎、肺气肿等引起的哮喘。80年代初，美国一家公司意外地发现，将一定量的盐酸克伦特罗药物添加在饲料中，可明显促进动物生长，并增加瘦肉率。随后，这一新发现在一些国家被应用于养殖业。盐酸克伦特罗进入体内后具有分布快、消除慢的特点，能够改变营养的代谢途径，促进动物肌肉、特别是骨骼肌蛋白质的合成，抑制脂肪的合成和积累，从而使生长速度加快、瘦肉相对增加。一般来说，饲料中添加适量盐酸克伦特罗后，可使饲料转化率、生长速率、酮体瘦肉率提高10%以上，所以也称它为“瘦肉精”。基于食用动物内脏而导致的中毒事件的不断发生，欧盟很快作出了反映：严禁在饲料中添加盐酸克伦特罗类药物。美国食品与药品管理局(FDA)也将肉品中的盐酸克伦特罗残留作为必检项目。FDA和世界卫生组织(WHO)还制定了畜产品中盐酸克伦特罗的最高残留限量：动物肌肉中最高限量为0.2ug/kg、肝脏中最高限量为0.6ug/kg、肾脏中最高限量为0.6ug/kg、动物脂肪中最高限量为0.2ug/kg和奶制品中最高限量为0.05ug/kg。至此，“瘦肉精”在动物生产与饲料加工中全面被禁止使用。近年来动物性产品中盐酸克伦特罗残留对人类健康造成的危害和对生态食物链所造成的破坏已经引起高度的重视。
　　2、 酶联免疫分析技术(EIA)的简介
　　酶联免疫分析技术是“迈向21世纪的医学检验技术”之一，其发展趋势是：新标记物的发展与联合应用、单克隆以及基因工程抗体的应用及免疫放大技术，可明显提高检测特异性，灵敏度可达ng/ml水平，即可实现分子水平的检测。
　　目前，检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析技术是ELISA技术。ELISA法可对动物尿液和血清中的β-兴奋剂残留进行直接分析，该方法既适于实验室大量样品的检测，也适于屠宰场地大量样品的迅速检测。美国、英国和德国的公司均开发出了检测肉品、饲料中CLB残留的ELISA试剂盒。中国在应用EIA检测CLB方面的研究起步晚，但近几年取得了明显的进展，目前已有几种试剂盒研制开发成功。ELISA检测试剂盒优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速、价格便宜。
　　3、 试剂盒原理
　　MaxsignalTM盐酸克伦特罗酶联免疫反应测试盒基于竞争性免疫反应原理，含有盐酸克伦特罗的抗原已经包被于微孔板上，吸附在孔内的药物抗原与被测的样品中药物竞争性与药物一抗相结合。当与样品药物相结合的药物抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，与经酶标记的二抗相结合，酶底物在酶作用下产生蓝色产物，加酸终止反应，此时蓝色产物就会转化成黄色，在450nm波长测定其吸收值(OD值)。OD值的大小与样品中克伦特罗的含量成反比。
　　4、 试剂盒与试剂溶液的准备
　　4.1、 试剂盒的组成部分：
　　已包被抗原的酶标板(96孔)，标准溶液(0ppb，0.05ppb，0.15ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb)，盐酸克伦特罗一抗(15ml)，100倍浓缩偶联酶标记二抗体(250ul)，酶标记二抗体稀释液(20ml)，20倍浓缩工作洗液(28ml)，终止液(20ml)，TMB底物溶液(12ml)，200倍浓缩样品提取液(25ml)，样品平衡液(0.5ml)，10倍浓缩PBS溶液(25ml)。
　　4.2、 试剂盒的保存：
　　试剂盒应当在2～8℃的温度下储存，有效期为一年，如果超过3个月不使用试剂盒，应将一抗和二抗溶液放置在-20℃的温度下储存。
　　4.3、试剂溶液使用前的准备：
　　所有的试剂在使用之前应将其回温至室温(约半小时)，并在使用试剂前轻微摇动几下，以保证合理的浓度。
　　4.3.1、样品提取液的准备：按1：199的比例配置样品提取浓缩液和蒸馏水。
　　4.3.2、PBS溶液的准备：按1：9的比例配置PBS浓缩液和蒸馏水。
　　4.3.3、二抗工作液的准备：按1：99的比例配制二抗浓缩液和二抗稀释液，避光保存。
　　4.3.4、工作洗液的准备：按1：19的比例配置洗涤浓缩液和蒸馏水。
　　5、样品的提取与前处理
　　5.1、饲料样品的提取与处理
　　称取饲料样品0.5g至50ml离心管中，加入样品提取液10ml，漩涡振荡1min，室温下5000转/min离心5min。移取上清液0.5ml至另一离心管中，覆盖瓶盖或封口膜，75℃孵育5min，漩涡振荡1min，室温下5000转/min，离心5min。移取上清液0.2ml至安培瓶中，加入5ul样品平衡液，摇匀，待检测。
　　5.2、猪尿样品的前处理
　　量取猪尿样品5ml，至50ml离心管中，5000转/min离心5min。移取上清液0.2ml、PBS溶液0.8ml至安培瓶中，摇匀，待检测。
　　5.3、猪饮用水样品的前处理
　　移取适量猪饮用水样品至50ml离心管中，5000转/min离心5min。移取上清液0.5ml、PBS溶液0.5ml至安培瓶中，摇匀，待检测。
　　6、酶联免疫反应测试步骤
　　6.1、加入50ul的标准品和样品所设定的酶标板孔中;
　　6.2、在每孔中加入100ul一抗，轻摇微孔板混匀1min;
　　6.3、室温下(20～25℃)孵育30min;
　　6.4、洗板3次，每次加入250ul洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干;
　　6.5、每孔加入150ul二抗(避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖微孔板);
　　6.6、 室温下(20～25℃)孵育30min;
　　6.7、 洗板3次，每次加入250ul洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干;
　　6.8、加入100ul的TMB底物溶液(底物本身无色，但加入到酶标板微孔中会出现变化为蓝色的反应)，避光培养15min;
　　6.9、加入100ul的反应终止液，在波长450nm的酶标仪下读OD值。
　　7、检测结果与分析
　　7.1、 生长育肥猪配合饲料的检测数据及数据分析
　　7.1.1、生长育肥猪配合饲料的检测数据
　　表1、标准曲线

标准浓度(ppb)	浓度对数	OD450-1	OD450-2	平均OD	相对吸光度
0.00	/	2.326	2.274	2.300	100.0
0.05	1.30	2.107	2.054	2.081	90.5
0.15	0.82	1.741	1.776	1.759	76.5
0.50	0.30	1.297	1.218	1.258	54.7
1.50	0.18	0.886	0.890	0.888	38.6
4.50	0.65	0.616	0.608	0.612	26.6
r=0.9969 斜率=33.7652 截距=46.5785

　　表2、离散系数

标准浓度(ppb)	检测个数	CV(%)
0.00	8	2.6
0.05	8	3.3
0.15	8	2.8
0.50	8	2.4
1.50	8	2.8
4.50	8	2.1

　　表3、阳性添加回收率

标准浓度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	2.096	2.082	2.089	90.8	0.049	98.0
0.15	1.701	1.716	1.709	74.3	0.151	100.7
0.50	1.308	1.304	1.306	56.8	0.499	99.8
平均回收率(%)=99.5

　　表4、饲料样品检测结果

样品编号	样品质量(g)	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
A1	0.5012	2.908	2.876	125.7	0.090
A2	0.5016	2.920	2.893	126.4	0.087
A3	0.5010	2.611	2.659	114.6	0.194
A4	0.5021	2.696	2.699	117.3	0.161
A5	0.5026	2.762	2.827	121.5	0.121
A6	0.5009	2.889	2.818	124.1	0.101
A7	0.5022	2.734	2.751	119.2	0.141
A8	0.5015	2.887	2.770	123.0	0.109
A9	0.5019	2.909	2.107	109.0	0.283
A10	0.5012	2.795	2.908	124.0	0.102
A11	0.5018	2.785	2.693	119.1	0.142
A12	0.5025	2.715	2.652	116.7	0.168
A13	0.5010	2.754	2.757	119.8	0.136
A14	0.5011	2.805	2.851	123.0	0.109
A15	0.5020	2.800	2.674	119.0	0.143
A16	0.5005	2.705	2.749	118.6	0.148
A17	0.5018	2.791	2.666	118.6	0.147
A18	0.5023	2.793	2.908	123.9	0.102
A19	0.5026	2.646	2.694	116.1	0.175
A20	0.5026	2.792	2.706	119.5	0.138
A21	0.5016	2.728	2.866	121.6	0.120
A22	0.5006	2.817	2.967	125.7	0.090
A23	0.5007	2.707	2.551	114.3	0.197
A24	0.5022	2.760	2.788	120.6	0.128
A25	0.5006	2.691	2.777	118.9	0.145
A26	0.5020	2.820	2.983	126.2	0.088
A27	0.5012	2.746	2.766	119.8	0.135
A28	0.5015	2.704	2.675	116.9	0.165
A29	0.5016	2.728	2.709	118.2	0.151
A30	0.5010	2.880	2.937	126.5	0.086
A31	0.5019	2.735	2.648	117.0	0.164
A32	0.5015	2.207	2.292	97.8	0.608
A33	0.5023	2.713	2.858	121.1	0.124
A34	0.5008	2.957	2.898	127.3	0.081
A35	0.5002	2.726	2.670	117.3	0.161
A36	0.5024	2.684	2.662	116.2	0.173
A37	0.5017	2.687	2.734	117.8	0.155
A38	0.5018	2.847	2.831	123.4	0.106
A39	0.5026	2.636	2.594	113.7	0.206
A40	0.5021	2.691	2.649	116.1	0.175
A41	0.5009	2.753	2.714	118.8	0.145
A42	0.5025	2.874	2.840	124.2	0.100

　　7.1.2、生长育肥猪配合饲料的检测数据分析
　　依据农业部所指定的方法“NY438-2001饲料中盐酸克伦特罗的测定”中规定的最低检测限为0.01mg/kg，当测定结果小于0.01mg/kg时，判定为“阴性”，检测结果按“未检出”计，反之按“NY438-2001”处理。
　　把0.01mg/kg换算成以ppb为单位是10ppb。饲料在前处理过程中被稀释20倍，表4所列出的浓度值(conc)是经过酶联免疫分析检测软件处理后的最终浓度值，表中所列出是数值是已经乘以稀释倍数后的浓度值。
　　通过表4可以看出，对检测的饲料样品均小于“NY438-2001”所规定的10ppb，检测结果均按未检出计。可以反应出，目前市场上的生长育肥猪饲料中没有添加瘦肉精，饲料质量安全可靠。通过表1可知标准曲线的斜率(r值)达到0.9969，高于规定的0.98;表2可以看出离散系数(CV值)不高于3.3%;表3可以看出阳性添加回收率平均达到99.5%，高于试剂盒中所规定的75～95%的回收率数值;表明此次检测准确可靠。
　　7.2、 生长育肥猪猪尿的检测数据及数据分析
　　7.2.1、生长育肥猪猪尿的检测数据
　　表5、标准曲线

标准浓度(ppb)	浓度对数	OD450-1	OD450-2	平均OD	相对吸光度
0.00	/	3.452	3.512	3.482	100.0
0.05	1.30	3.376	3.318	3.347	96.1
0.15	0.82	2.783	2.800	2.792	80.2
0.50	0.30	1.934	2.049	1.992	57.2
1.50	0.18	1.260	1.322	1.291	37.1
4.50	0.65	0.843	0.816	0.830	23.8
r=0.9975 斜率=38.2710 截距=46.6559

　　表6、离散系数

标准浓度(ppb)	检测个数	CV(%)
0.00	8	2.5
0.05	8	3.6
0.15	8	2.8
0.50	8	2.4
1.50	8	2.8
4.50	8	2.6

　　表7、回收率

标准浓度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	3.366	3.358	3.362	96.6	0.050	100.0
0.15	2.775	2.728	2.752	79.0	0.143	95.3
0.50	2.056	1.989	2.023	58.1	0.503	100.6
平均回收率(%)=98.6

　　表8、猪尿样品检测结果

样品编号	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
B1	3.584	3.661	104.0	0.158
B2	3.368	3.634	100.5	0.195
B3	3.471	3.533	100.6	0.195
B4	3.617	3.571	103.2	0.166
B5	3.462	3.448	99.2	0.212
B6	3.550	3.415	100.0	0.202
B7	3.375	3.351	96.6	0.248
B8	3.556	3.358	99.3	0.211
B9	3.592	3.610	103.4	0.164
B10	3.562	3.571	102.4	0.174
B11	3.322	3.375	96.2	0.254
B12	3.324	3.472	97.6	0.233
B13	3.724	3.749	107.3	0.130
B14	3.663	3.776	106.8	0.134
B15	3.412	3.474	98.9	0.216
B16	3.477	3.547	100.9	0.192
B17	3.540	3.606	102.6	0.173
B18	3.524	3.554	101.6	0.183
B19	3.709	3.801	107.8	0.126
B20	3.705	3.691	106.2	0.139
B21	3.829	3.743	108.7	0.119
B22	3.698	3.685	106.0	0.141
B23	3.682	3.448	102.4	0.175
B24	3.562	3.694	104.2	0.157
B25	3.714	3.738	107.0	0.132
B26	3.657	3.753	106.4	0.137
B27	3.390	3.546	99.6	0.207
B28	3.663	3.525	103.2	0.166
B29	3.405	3.529	99.6	0.207
B30	3.644	3.589	103.9	0.160
B31	3.546	3.525	101.5	0.184
B32	3.691	3.822	107.9	0.126
B33	3.824	3.749	108.7	0.119
B34	3.706	3.840	108.4	0.122
B35	3.735	3.654	106.0	0.141
B36	3.692	3.648	105.4	0.146
B37	3.513	3.580	101.9	0.181
B38	3.696	3.726	106.6	0.136

　　7.2.2、生长育肥猪猪尿的检测数据分析
　　依据国家所定的推荐标准“GB/T5009.192-2003”中第三法规定的最低检测限量为0.5ug/kg，当测定结果小于0.5ug/kg时，判定为“阴性”，检测结果按“未检出计”，反之按“GB/T5009.192-2003”第一法处理。
　　把0.5ug/kg换算成以ppb为单位是0.5ppb。生长育肥猪猪尿样品在前处理过程中被稀释5倍，表8所列出的浓度值(conc)是经过酶联免疫分析检测软件处理后的最终浓度值，表中所列出是数值是已经乘以稀释倍数后的浓度值。
　　通过表8可以看出，对检测的生长育肥猪猪尿样品均小于“GB/T5009.192-2003”所规定的0.5ppb，检测结果均按未检出计。可以反应出，目前生猪的养殖企业所生产的肉制品质量安全可靠。通过表5可知标准曲线的斜率(r值)达到0.9975，高于规定的0.98;表6可以看出离散系数(CV值)不高于3.6%;表7可以看出阳性添加回收率平均达到98.6%，高于试剂盒中所规定的75～95%的回收率数值;表明此次检测准确可靠。
　　7.3、生长育肥猪饮用水的检测数据及数据分析
　　7.3.1、生长育肥猪饮用水的检测数据
　　表9、标准曲线

标准浓度(ppb)	浓度对数	OD450-1	OD450-2	平均OD	相对吸光度
0.00	/	3.558	3.563	3.561	100.0
0.05	1.30	3.372	3.365	3.369	94.6
0.15	0.82	2.825	2.837	2.831	79.5
0.50	0.30	1.960	2.071	2.016	56.6
1.50	0.18	1.275	1.336	1.306	36.7
4.50	0.65	0.852	0.825	0.839	23.6
r=0.9973 斜率=37.7147 截距=46.1449

　　表10、离散系数

标准浓度(ppb)	检测个数	CV(%)
0.00	8	2.6
0.05	8	3.5
0.15	8	2.7
0.50	8	2.4
1.50	8	2.4
4.50	8	2.6

　　表11、回收率

标准浓度(ppb)	OD450-1	OD450-2	平均OD	(b/b0)*100	Conc(ppb)	回收率(%)
0.05	3.396	3.412	3.404	95.6	0.049	98.0
0.15	2.756	2.768	2.762	77.6	0.147	98.0
0.50	2.020	2.066	2.043	57.4	0.504	100.8
平均回收率(%)=98.9

　　表12、生长育肥猪饮用水样品检测结果

样品编号	OD-1	OD-2	(b/b0)*100	Conc(ppb)
C1	3.728	3.736	104.8	0.056
C2	3.532	3.580	99.9	0.075
C3	3.721	3.650	103.5	0.060
C4	3.574	3.521	99.6	0.076
C5	3.746	3.728	105.0	0.055
C6	3.164	3.105	88.0	0.155
C7	3.758	3.710	104.9	0.055
C8	3.597	3.586	100.9	0.071
C9	3.661	3.620	102.2	0.065
C10	3.488	3.476	97.8	0.085
C11	3.660	3.628	102.3	0.065
C12	3.718	3.756	105.0	0.055
C13	3.799	3.729	105.7	0.053
C14	3.422	3.518	97.5	0.087
C15	3.549	3.466	98.5	0.082
C16	3.506	3.518	98.6	0.081
C17	3.474	3.429	96.9	0.090
C18	3.466	3.406	96.5	0.092
C19	3.377	3.327	94.1	0.107
C20	3.480	3.416	96.8	0.091
C21	3.368	3.320	93.9	0.108
C22	3.572	3.524	99.6	0.076
C23	3.807	3.767	106.4	0.051
C24	3.815	3.835	107.4	0.047
C25	3.730	3.698	104.3	0.057
C26	3.760	3.750	105.5	0.053
C27	3.183	3.126	88.6	0.150
C28	3.624	3.594	101.4	0.069
C29	3.653	3.621	102.1	0.065
C30	3.723	3.711	104.4	0.057
C31	3.727	3.701	104.3	0.057
C32	3.744	3.758	105.4	0.054
C33	3.661	3.649	102.7	0.063
C34	3.736	3.762	105.5	0.054
C35	3.521	3.496	98.5	0.082
C36	3.630	3.652	102.3	0.065
C37	3.518	3.522	98.9	0.080
C38	3.369	3.327	94.0	0.107

　　7.3.2、生长育肥猪饮用水的检测数据分析
　　参照 “NY438-2001饲料中盐酸克伦特罗的测定”中规定的最低检测限为0.01mg/kg，当测定结果小于0.01ug/ml时，判定为“阴性”，检测结果按“未检出”计，反之按“NY438-2001”处理。
　　把0.01ug/ml换算成以ppb为单位是10ppb。生长育肥猪饮用水样品在前处理过程中被稀释2倍，表12中所列出的浓度值(conc)是经过酶联免疫分析检测软件处理后的最终浓度值，表中所列出是数值是已经乘以稀释倍数后的浓度值。
　　通过表12可以看出，对检测的生长育肥猪饮用水样品均小于“NY438-2001”所规定的10ppb，检测结果均按未检出计。可以反应出，目前的生猪养殖企业没有向生长育肥猪饮用水中添加瘦肉精。通过表9可知标准曲线的斜率(r值)达到0.9973，高于规定的0.98;表10可以看出离散系数(CV值)不高于3.5%;表11可以看出阳性添加回收率平均达到98.9%，高于试剂盒中所规定的75～95%的回收率数值;表明此次检测准确可靠。
　　8. 讨论
　　8.1、不同批次的试剂盒不能混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液的正确配制才能达到准确无误的效果。
　　8.2、检测过程中应尽量保持室温20～25℃，避免在通风口操作防止温度过低、过热或蒸发都会影响检测数据的准确性。同样不应在阳光直射下实验，防止过热或蒸发带来的影响，阳光直射下操作，还会给二抗、一抗溶液与吸附在试剂盒微孔的抗原的酶联免疫反应起到不利影响。
　　8.3、在孵育期间，如果工作台温度过低，应适当铺垫若干纸巾或其它物料。
　　8.4、水质对检测结果的影响很重要，应确保使用蒸馏水或者去离子水。
　　8.5、加入样品或者试剂到微孔板时，吸嘴靠于微孔板壁，尽量接近微孔底部，但不应接触到底部，以免划伤吸附在微孔内的抗原。
　　8.6、孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品，有利于检测结果的准确性。
　　8.7、从低浓度到高浓度地添加标准品，可降低影响标准曲线质量的风险。
　　参考文献(引用标准)：
　　1、 中华人民共和国农业行业标准，饲料中盐酸克伦特罗的测定，Determination of clenbuterol hydrochloricde in feed，NY438-2001，中华人民共和国农业部2001-02-12发布。
　　2、 中华人民共和国国家标准，动物性食品中克伦特罗残留量的测定，Determination of 4-amino-3,5-dichloro-α[(tert-butylamino)methyl]-benzyl alcohol (clentuterol) residues in animal foods，GB/T5009.192-2003,中华人民共和国卫生部/中国国家标准化管理委员会2003-08-11发布。
　　3、 中华人民共和国国家标准，饲料釆样，Feeding stuffs-sampling，GB/T14699.1-2005，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局/中国国家标准化管理委员会2005-03-23发布。
　　4、 中华人民共和国国家标准，分析实验室用水规格和试验方法，Water for analytical laboratory use-specification and test methods，GB6682-92，国家技术监督局1992-06-29发布。
　　注：此篇论文没有引用参考文章与论文，上面所引用的国家标准可视作参考文献。
　

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