三颗针活性成分——盐酸小檗碱含量的有效测定方法

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　　三颗针活性成分——盐酸小檗碱含量的有效测定方法

　　李葱晓1 王志祥1 宋宏晓2 刘素梅3 刘建华1　 赵蕾1

　　1.河南农业大学 河南郑州 450002 　 2.河南省洛阳市动物疫病预防控制中心　河南洛阳　471002 3.河南省兽药监察所 河南郑州 450008
　　摘要：建立用高效液相色谱法(HPLC)测定三颗针活性成分中盐酸小檗碱含量的方法。 方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，乙腈-0.03mol/mL磷酸二氢钾(体积比为35：65)为流动相;检测波长：345nm;流速：1mL/min-1;柱温：25℃。结果：盐酸小檗碱在2.138-106.9μg范围内线性关系良好，r=0.999995;具有较好的稳定性、重现性和精密度。结论：该方法准确、可靠、专属性强，可作为三颗针活性成分中盐酸小檗碱含量的有效测定方法。
　　关键词：盐酸小檗碱;高效液相色谱法;三颗针
　　三颗针为小檗科(Berberidaceae)小檗属(Beris)植物的俗称，其含有的生物碱主要有小檗碱、小檗胺、巴马亭、药根碱等，具有清热燥湿、泻火解毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降脂调脂的作用。三颗针活性成分是河南农业大学绿色饲料实验室拟开发的饲料添加剂。本实验提取三颗针活性成分，采用HPLC测定其中盐酸小檗碱的含量。为将三颗针活性成分开发为饲料添加剂的用量提供参考依据。
　　文献报道[1]测定三颗针中盐酸小檗碱的含量所采用的方法有紫外、薄层层析法，容量法等。但以上方法误差大，经查阅资料[2]后，采用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量，并对测定方法进行方法学考查。
　　1 材料
　　1.1 仪器　Waters1525高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器;MILLI-Q型超纯水系统，梅特勒320型酸度计，KQ-250DB型超声波清洗器，METTLER AE240电子分析天平。
　　1.2 药材　称取三颗针根茎，置于10倍0.25%的硫酸溶剂中，在80℃烘箱中浸泡24小时，用4层纱布过滤，滤渣用6倍量硫酸同法再提取1次，合并滤液，加石灰乳调pH=11，静置过夜，抽滤，滤液中加5%食盐，静置过夜，抽滤得滤饼，即三颗针活性成分粗品;粗品加30倍纯化水，加热煮沸5min，趁热抽滤，滤液在60℃时，加入浓盐酸调pH=1，静置过夜，抽滤即得三颗针活性成分精品[3~6]。
　　1.3 试剂　乙腈为色谱纯，其它为分析纯。盐酸小檗碱标准品由中国药品生物制品检定所提供，编号为713。
　　2 方法
　　2.1 色谱条件　色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250×4.6mm，5μm);流动相：乙腈一0.03mol/mL磷酸二氢钾(35：65);流速1mL/min-1;检测波长345nm;柱温：25℃，进样量为10μL。
　　2.2 图谱 对照品的HPLC图谱见图1，保留时间t=7.8min。供试品图谱见图2。两图谱的小檗碱峰基本一致，理论塔板数为8715。
　　作者介绍：李葱晓。河南农业大学2005级研究生，专业：动物营养与饲料科学。
　　
　　2.3 对照品溶液的制备　精密称取盐酸小檗碱对照品10.69mg，以甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中，即为0.2138mg/mL的储备液。
　　2.4 供试品溶液的制备 精密称取三颗针活性成分50mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液约20mL，超声处理使其全部溶解，加甲醇溶液至刻度，摇匀;精密量取1mL，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀，经0.25μm滤膜过滤，取续滤液即得。依法制得1、2、3、4、5五个样品溶液。
　　2.5 测定 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得结果。
　　3 实验结果
　　3.1 线性关系考察
　　分别吸取储备液适量，配制成浓度(μg/mL)为2、5、10、20、50、100的对照品溶液，按上述色谱条件，将不同浓度的标准品溶液进样，测定。以峰面积(Y)为纵坐标，以进样量X(mg)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程Y=37073.15X-823.51，相关系数：r=0.999995，r2=0.999990，结果表明：盐酸小檗碱在2.138-106.9μg之间呈良好线性关系，详见表1。
　　表1 盐酸小檗碱进样量与峰面积线性关系考察结果

进样量（μg）	2.138	5.345	10.69	21.38	53.45	106.9
峰面积	83965	198472	393925	785752	1980235	3963746

　　3.2 稳定性实验
　　随机取1号样品溶液，于0，0.5，1，2，4，8，12h进行含量测定，盐酸小檗碱峰面积的相对标准偏差RSD=1.109%，稳定性良好，详见表2。
　　表2 　稳定性实验结果

时间（h）	0	0.5	1	2	4	8	12	RSD%
峰面积	757173	759784	758595	772199	780626	768004	768833	1.11

　　3.3 重现性实验
　　将供试品 1、2、3、4、5进行平行测定，结果供试品中盐酸小檗碱的平均含量为101.1%，盐酸小檗碱峰面积RSD=0.616%，结果表明重现性良好。详见表3。
　　表3 重现性实验结果

样品编号	1	2	3	4	5	Mean%	RSD%
峰面积	757450	745261	744832	759419	764157	101.1	0.616

　　3.4 精密度实验
　　精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10μL测定，连续进样5次，测定峰面积，求得盐酸小檗碱峰面积RSD=0.246%，表明精密度良好，详见表4。
　　表4　 　精密度实验结果

进样次数	1	2	3	4	5	RSD%
峰面积	757173	757727	761599	759784	757652	0.246

　　4 讨论
　　4.1实验结果显示：河南农大绿色饲料实验室拟开发饲料添加剂中盐酸小檗碱的含量为101.1%，为其进一步的开发为饲料添加剂提供参考依据。
　　4.2实验中所采用的色谱条件是在张晶，杨朝莲及刘建华的实验条件下进行改进的一种新的条件。[7~9]
　　4.3实验所采用的色谱条件，供试品与标准品保留时间基本一致，此方法稳定性、重现性和精密度均良好，可作为三颗针活性成分中盐酸小檗碱含量的一种有效测定方法。
　　参考文献
　　[1]王勤，马志刚等.甘肃产三颗针植物中生物碱测定及分布状况研究[J].分析测定学报2004,23(3):54-57.
　　[2]李亢宗，韩跃武.高效液相色谱法测定三颗针中生物碱的含量[J].兰州医学院学报，1994,20(1):1-2.
　　[3]廖志新，李玉林，纪兰菊，孙洪发.青海产三颗针中盐酸小檗碱的最佳提取工艺研究[J].天然产物研究与开发，1997,10(2)：62-65.
　　[4]王水晶，王洪福.从野生植物三颗针中提取黄连素[J].绵阳师范高等专科学校学报，2001,20(5)：43-47.
　　[5]张福维，关崇新，高坤.盐酸小檗碱提取实验的改进[J].大学化学，2003,18(4)：47-49.
　　[6]袁丽，戴云花，何迎春，杨宏健，肖美凤.正交实验优选三颗针中小檗碱的提取工艺[J].怀化医专学报，2005,4(1)：34-36.
　　[7]张晶.HPLC法测定盐酸小檗碱预混剂的含量[J].中国兽药杂志，2006,40(7)：34-36.
　　[8]杨朝莲，冯华，张运杰，武孔去，靳风云，梁光义.HPLC法测定三颗针中盐酸小檗碱的含量[J].贵阳中医学院学报，2005,27(3)：57-58.
　　[9]刘建华，王志祥，刘岭.HPLC法测定中草药饲料添加剂中盐酸小檗碱含量[J].兽药与饲料添加剂，2006,11(2)：29-30.

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