抗菌肽真的能替代抗生素吗？

索罗狗 · 发表于 2010-7-6 15:05:07

本帖最后由索罗狗于 2010-7-6 15:19 编辑

很多人在接触到抗菌肽的时候，对于抗菌肽是否真能替代抗生素这个问题有很大疑惑，下面转载一篇浙江大学在中国兽医学报上发表的文章，相信大家在看后能减少一些疑惑。

抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较

汪以真,王中强,许梓荣

(浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养重点实验室,浙江杭州310029)

摘要:应用由Hancock实验室改进的微量肉汤稀释法测定了cecropin P1、cecropin A、magainin 2、defensin 1、bactenecin、lactoferricin和indolicidin等7种抗菌肽和盐酸金霉素、去甲万古霉素、土霉素、强力霉素等4种抗生素的体外抗菌活性,并且使用薄层琼脂糖孔穴扩散法比较了抗菌肽中cecropin P1和cecropin A与土霉素和呋喃唑酮对大肠杆菌K88的抑菌效果。结果发现,抗菌肽与抗生素一样对几种革兰氏阳性菌和阴性菌都有不同程度的抗菌效果。其中cecropin A、cecropin P1和defensin 1对大肠杆菌的2个菌株ATCC25922和K88的抗菌活性高于抗生素,defensin1是各种抗菌肽中对金黄色葡萄球菌抗菌效果最好的。抗生素对试验用金黄色葡萄球菌的抑制活性总体上要好于抗菌肽。与抗生素相比,cecropin A、cecropin P1和indolicidin对猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌具有更好的抗菌效果。另外,抗菌肽的抑菌圈边缘十分清晰,而抗生素的整个抑菌圈都比较模糊且界线不明。因此,从抗菌效果方面考虑,抗菌肽可以代替抗生素用于疾病的预防和治疗。

关键词:抗菌肽;抗生素;药敏试验

近些年来,畜产品中的抗生素药物残留问题越来越受到人们的重视,许多国家包括我国已经严格限制将抗生素作为保健和促生长剂添加到畜禽饲料中,有的甚至禁止任何抗生素的使用。同时,由于抗生素的乱用与滥用,也造成了许多细菌产生了耐药菌株,并且其出现的频率已超过抗生素新药的开发速度,给疾病的治疗带来了很大的难度。因此,寻找安全高效的抗生素替代品就显得十分重要。抗菌肽是生物体内存在的一种天然抗菌活性物质,已经从哺乳动物(包括人)及昆虫、两栖动物中发现了几百种抗菌肽,其中有些已经分离提取了出来,并对其结构、抗菌活性等作了许多的研究,发现其抗菌活性高效、广谱,并且本身无毒、无害[1,2]。天然的抗菌肽主要存在于生物体中的中性粒细胞、舌部、气管和小肠表面,其自身携带有大量的正电荷[2,3]。尽管目前人们对其抗菌机理还没有完全弄清楚,但比较一致的观点认为,它们是通过横跨膜内外的离子通道的形成来达到杀菌作用的,并且这种作用不需要特殊的受体[2~6]。正是由于这种独特的作用机制,许多人认为其不易产生耐药性,是一种高效安全的预防、治疗疾病的药物[6]。本试验通过体外试验研究,比较了7种抗菌肽和4种临床使用的抗生素对几种革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌效果,旨在为抗菌肽替代抗生素应用于生产提供资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、药品及设备抗菌肽cecropin P1(猪)、ce-cropin A (猪)、magainin 2 (蛙)、defensin 1 HNP-1 (人)、bactenecin(牛)、indolicidin和lactoferricin(牛),购自美国肽公司(American Peptide Company),其氨基酸序列见表1;4种抗生素为盐酸金霉素(Chlortetracycline hydrochloride)、去甲万古霉素(Demethylvancomycin)、土霉素(Oxytetracycline)和强力霉素(Doxycycline),购自中国药品生物制品检定所;琼脂粉(纯化),购自中国医药(集团)上海化学试剂公司;Pep-tone和yeast extract,购自OXOID公司;琼脂糖(agarose),购自上海生工;牛血清白蛋白(bovine serumal bumin,BSA),购

自杭州四季青生物工程材料有限公司;乙酸(36%),购自中国医药(集团)上海化学试剂公司;Mueller-Hinton(MH)肉汤,购自DIFCO公司;96孔平板(平底)和聚丙烯离心管,购自Nunclon公司;Model 550型酶标仪,购自BIO-RAD公司;9cm培养皿及摇床,实验室自备。

1.2 细菌大肠杆菌(E.coli)K88、大肠杆菌ATCC(America Type Culture Collection,美国标准菌库)25922、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella chloleraesuis)ATCC 50020、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 50013和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923,由浙江省卫生防疫中心提供,-20℃暗处保存于20%甘油冷冻管中备用。

1.3 药敏试验

1.3.1
微量肉汤稀释法(broth microdilution method) 该方法是由NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)推荐的在体外对需氧型细菌进行药敏试验的方法[7]。由于抗菌肽自身结构的特殊性,该方法中有些地方不适用于对其进行抗菌活性的测定,于是Hancock实验室对其做了相应的改进[8],已有对比试验证明改进后的方法更能准确反映抗菌肽的抗菌效果[9]。首先用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1 280 mg/L的储备液,然后用等量无菌的0.02%乙酸(含0.4% BSA)稀释,再用0.01%乙酸(含0.2% BSA)溶液对等量稀释后的溶液再进行一系列的双倍稀释,得到质量浓度为640、320、160……1.25 mg/L的系列稀释液,4℃下保存备用[8]。将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养,挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤,37℃180 r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2×105~7×105CFU/mL,向无菌的96孔平板中的1~11孔各加入100μL的菌液,12孔不加菌液而加100μL MH肉汤。然后从1~10孔逐一加入相应的待测抗菌肽,11孔作为扫描对照孔不加肽,37℃90 r/min培养18~24 h,这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64、32、16……0.125 mg/L。最小抑菌浓度MIC(minimal inhibitoryconcentration)就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度[8]。用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描,肽的MIC的确定按照比对照孔(11孔)的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10μL涂布到MH琼脂平板上,37℃培养18 h,以此来确定肽的最小杀菌浓度( MBC )。MBC ( minimal bactericidal concentration)就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度[8]。

1.3.2
薄层琼脂糖孔穴扩散法在7 mL LB+agarose培养基中,加入培养至对数生长期的E.coliK88(107CFU/mL)10μL,摇匀,倒入培养皿,待其冷却凝固后,用打孔器在培养基上等距离打5个孔(直径3 mm),标号1、2、3、4、5。第1组分别加入同质量浓度的cecropin A(200、100 mg/L)和cecropinP1到1、2孔和3、4孔中,5号孔加5μL 0.01% HAC作为对照。第2组分别加入同浓度的土霉素、呋喃唑酮、cecropin P1和cecropin A,5孔号加5μL 0.01% HAC作为对照。各组均做3个重复,37℃倒置过夜培养。

2 结果

2.1 微量肉汤稀释法见表2。结果表明,抗菌肽与抗生素一样对几种革兰氏阳性菌和阴性菌都有较好的抗菌效果。与抗生素相比,抗菌肽对大肠杆菌的2个不同菌株的抗菌活性更高,其中cecropin A、cecropin P1及defensin 1的活性最高,尤其cecropin A和defensin 1的MIC值只有0.25 mg/L,远低于4种抗生素的MIC。这一方面说明2类抗菌剂对体内主要的有害菌都有很好的作用效果,另一方面说明总体上抗菌肽的敏感性高于抗生素,杀菌效果更好。另外,cecropin A、cecropin P1和indolicidin对猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗菌效果也要好于抗生素,并且它们对前者的活性要更高。土霉素、盐酸金霉素和强力霉素是动物生产上比较常用的几种抗生素,从表2可以看出,这3种抗生素对几种试验菌株都有较好的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌的抗菌效果要好于抗菌肽。去甲万古霉素对各试验菌株的活性都比较低,是所有试验抗菌剂中效果最差的。各试验菌株对抗菌肽中的cecropinA和P1都比较敏感。Indolicidin在几种抗菌肽中对金黄色葡萄球菌的效果最好,bactenecin的活性相对较低。

2.2 薄层琼脂糖孔穴扩散法几种抗菌剂的杀菌效果见图1、2。抗菌肽的抑菌圈边缘十分清晰,整个抑菌圈呈现明亮状态,表示所到之处细菌的生长被完全抑制,而抗生素的抑菌圈比较模糊,界线也不是很分明。这说明抗菌肽的抑菌效果比抗生素更彻底。通过对抑菌圈大小比较也进一步验证了大肠杆菌对抗菌肽更敏感,更容易被其所抑制。

3 讨论

1949年Cyanamid公司科研人员发现金霉素有促生长的作用,由此开创了抗生素作为饲料添加剂使用的先河。此后的研究还发现,抗生素具有提高饲料利用率,提高产蛋率、孵化率及预防疾病的效果,使得大量的抗生素应用于动物生产[10]。从本试验也不难看出,以金霉素、土霉素和强力霉素为代表的常用作饲料添加剂的抗生素确有比较好的抗菌效果,尤其在对金黄色葡萄球菌要好于抗菌肽,但是对大肠杆菌的效果则要差得多。分析其原因,可能是作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌与革兰氏阴性菌在细胞膜的结构上存在很大差异。革兰氏阴性菌的细胞膜外侧面含有大量的带有负电荷的脂多糖(LPS),而抗菌肽本身是一种阳离子肽,携带大量的正电荷,因此很容易与其结合,形成离子通道,穿透细胞膜致死细菌。革兰氏阳性菌的细胞膜主要成分是肽聚糖(peptidoglycan,或称粘肽mucopeptide),由于其含有一些磷壁酸和氨基酸羧基而带有一定量的负电荷,这可能是导致其对抗菌肽的敏感性低于阴性菌的重要原因。不过这方面的研究报道也不尽一致,也有报道称某些抗菌肽对金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果[2,11]。这可能是由于选择的葡萄球菌的菌株不同,或者使用了不同来源的抗菌肽的缘故。正如试验中的Indolicidin,对葡萄球菌的抑制效果就比较明显。试验用的抗菌肽相互之间在活性上也存在较大差异,有些效果好于抗生素,有些不如抗生素。这是由抗菌肽自身的结构及其来源所决定的,正如抗生素相互之间的抗菌效果也有差别一样,我们正是要通过试验选择理想的抗菌肽作为抗生素的替代品。另外,抗菌肽还有抗真菌[2,4,12,13]、病毒[14,15]和原生动物[2]等作用。薄层琼脂糖孔穴扩散试验还进一步证明了抗菌肽的抑菌效果更彻底。这些都是抗生素所不及的。本试验中一些抗菌剂对细菌没有表现出明显的抑制效果,并不是说它没有抗菌活性,只是试验浓度范围内没有观察到,如果加大浓度,很可能会有抗菌效果出现。已有试验测得lactoferrincin(牛)对金黄色葡萄球菌HG386的MIC是75 mg/L,这也为我们针对不同的细菌选择不同的抗菌剂提供了依据。同时,如果以后抗菌肽作为抗生素的替代品添加到饲料中,这也可以指导最终的添加量。此外,抗菌肽之间的协同、拮抗作用的研究还不是很多,只有少量报道称一些抗菌肽之间存在协同作用[1],未见有拮抗作用的报道。相信随着对抗菌肽研究的进一步深入以及现代生物技术的发展,抗菌肽将会为抗菌治疗及新药的开发带来广阔的前景。