抗菌肽知识系列大讲堂（十）

轻松由我 · 发表于 2010-5-4 15:58:23

抗菌肽的基因工程表达（二）

酵母表达系统：

1. 酵母表达系统的特点
虽然大肠杆菌是目前最为成熟的基因表达系统，但作为原核生物，它不具有真核生物的基因表达调控机制，也不具有对外源蛋白的加工修饰能力。近年来，人们已经将注意力转移至跟大肠杆菌同样具有繁殖快、易于培养、遗传操作简单、可工业化生产等特点的酵母表达系统，并且除了上述优点以外还具有使蛋白折叠、磷酸化、糖基化、酰胺化等修饰能力，避免了蛋白以包涵体形式表达、活性降低等问题。

酵母表达系统中最早使用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曾经用其成功表达过干扰素、胰岛素等外源基因，但在工业应用时其缺点也逐渐显现出来，如培养基成本高、容易发生过度糖基化、质粒丢失、拷贝数下降等。为了克服酿酒酵母的局限，美国Daly等最先发展了以甲基营养型酵母(Methylotrophic yeast)为代表的第2代酵母表达系统。其中巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是发展最为迅速的，最初这种酵母菌是用于生产家畜饲料单细胞蛋白，它可以在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长，其细胞中含有醇氧化酶(Alcoholoxydase，AOX)、二羟丙酮合成酶、过氧化氢酶等甲醇代谢途径必须的酶。毕赤酵母表达系统具有多种有利于外源基因表达的优势，与其他系统相比，更加便捷、高效，近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种。美国FDA评价该系统是安全的，并且已有来自于该表达系统的蛋白类制剂获得批准。与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下特点：

(1)巴斯德酵母具有很强的醇氧化酶基因(AOX)启动子，可以严格调控异源蛋白的表达。

(2)巴斯德毕赤酵母有完备的发酵方法，可高密度连续培养，在发酵罐中细胞干重可达100g/l以上，便于工业化生产。

(3)巴斯德毕赤酵母的表达产物表达量较高，并且既可以在胞内积聚又可以分泌到细胞外，而其自身的分泌蛋白非常少，有利于纯化。

(4)异源蛋白借助质粒以单拷贝或多拷贝的形式整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，有助于稳定遗传。

(5)巴斯德毕赤酵母翻译后加工过程中的糖基化程度更合理。

当然除了上述优点，目前甲醇酵母表达系统也还存在着一些问题，如某些蛋白的表达量相对较低甚至不能表达；分泌表达产物不均一，存在聚合体、信号肽加工不完全、表达产物降解等。所以在实验中还需不断地摸索。

2. 基因的构建及表达
目的基因的获得可以从动物体中提取RNA，将其反转录扩增后得到cDNA，利用此方法已经得到猪抗菌肽PR-39基因；或根据抗菌肽氨基酸残基种类和其杀菌活性的相关性，替换某几个氨基酸或将2种抗菌肽基因结合构造杂合肽。如将cecropin Bl5和17等位点的氨基酸替换后，其抗菌活性明显提高；cecropin A N端1～7位和Milittin N端5～12位氨基酸杂合后，其产物具有热稳定性和高抑菌活性。目前在巴斯德毕赤酵母已表达的抗菌肽包括：人源抗菌肽LL-37，通过克隆cDNA，得到111 bp的重组基因，已在X一33中表达，所用质粒为pGAPZB；来源于中国家蚕的ABP—CM4，在GSll5中以pPICZaA为载体，得到了3．8 ku的表达产物；Jin等同样以pPICZaA为载体，在SMDll68中表达了cecropinA和magain-in2的杂合肽。