抗菌肽的基因工程表达(一) 天然抗菌肽主要来自昆虫,但其提取过程甚为复杂。一般需将虫体研磨、离心,上清液再经盐析、葡聚糖凝胶层析等一系列步骤纯化,才能去除其他杂蛋白,而产物浓度和回收率都不甚理想。用基因工程方法可以简化上述步骤,且产量可获明显提高。 基因的构建及表达 : 目的基因的获得可以从动物体中提取RNA,将其反转录扩增后得到cDNA,利用此方法已经得到猪抗菌肽PR-39基因;或根据抗菌肽氨基酸残基种类和其杀菌活性的相关性,替换某几个氨基酸或将2种抗菌肽基因结合构造杂合肽。如将cecropin Bl5和17等位点的氨基酸替换后,其抗菌活性明显提高;cecropin A N端1~7位和Milittin N端5~12位氨基酸杂合后,其产物具有热稳定性和高抑菌活性。
大肠杆菌表达系统基于大肠杆菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、也最完善的系统,但运用该系统表达抗菌肽则遇到很多困难,主要表现在2个方面。一是抗菌肽的宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性地抑制大肠杆菌等宿主细胞的增殖,从而影响抗菌肽的进一步表达;二是容易被降解。由于抗菌肽本身带有大量正电荷,因而对蛋白酶非常敏感,在表达胞中容易被降解,难以实现大量表达。融合表达是解决上述问题的主要方法。xu等以pTRX为载体,在大肠杆菌BL21中以与硫氧还蛋白(TRX)融合的方式表达了38个氨基酸残基的家蝇肽Mdmcec,目标蛋白用肠激酶切割下来,再用HPLC进行纯化,最后获得了11.2 mg/L的产量。但大肠杆菌表达产物均以包涵体的形式存在,需将细胞超声破碎后透析纯化,给后续处理带来困难。
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