有机矿物质添加物的“快速测定”

yisiyi

有机矿物质添加物的“快速测定”
        ——比色法铜和锌有机矿物质的金属络合度测定
　　Robert Holwerda著 张淑枝译 王永康校

　　微量矿物质含量及其生物有效性问题，对饲料配方者依然是一个棘手的挑战。一方面，这些微量元素是必需的营养物质，即使是很少的数量对动物的健康和生长也是至关重要的。另一方面，若补充过多，则伴随着中毒风险的增加。为了在日渐增多的微量矿物元素产品中迅速做出事先了解的选择，配方者通常需要了解矿物元素在水溶液中主要是呈游离态的或是络合态的。

　　许多实验室方法已经用于定量地回答这一问题。但是，这些方法昂贵且费时。有一种新的比色测定法可以定性地回答有机物的“络合”效率问题。这种“快速测定”依靠化学反应所诱导的颜色变化，类似于实验室的基础测试，但不是定量的。相比之下，比色测定更为低廉、快速并易在饲料厂或现场操作。

游离、络合以及鳌合态有机微矿
　　动物饲料中有机矿物元素产品通常包含游离和络合金属离子的混合物。离子化合物如硫酸锌，溶解释放游离和水合的金属离子，仅有水分子与金属离子相结合。相比而言，有机配体（organic-parters）通过单点的附着与金属元素相连接形成“络合”，或通过多点连接而形成“鳌合”。有机络合或鳌合形式添加的微量元素有提高金属元素生物可利用性、改善动物性能的潜力（Spears等, 1992）。

　　虽然络合或鳌合都不能绝对保证它们的生物有效性，但了解商品性矿物元素产品中游离、络合和鳌合金属的的相对数量，将有利于做出合理的选择。然而，通常有机微量元素供应商不提供测定游离、络合金属离子的定量方法，仅提供总金属元素的常规报告。

　　研究者已经提出了许多鉴别游离和络合金属元素的定量分析方法（见参考文献）。但是，为了满足日粮配方的即刻需求，配方者可能只是想要了解某些矿物产品的金属元素是否主要是游离的或是络合的。

氯醌酸盐比色指示剂
　　有机矿物元素络合效率的快速测定，采用氯醌酸（2, 5- 二羟基-3, 6-二氯-1, 4-苯醌），该酸易被中和（pKa1=0.7, pKa2=2.6；Martell等，2001），形成紫色的二价氯醌酸盐（CA2－）。指示剂三乙铵氯醌酸盐（TEAC）的合成和快速测定都颇为简单和直观，几乎在所有饲料实验室和饲料厂质检人员的能力范围之内。

　　当与金属离子相结合的时候，氯醌酸盐可以作为络合剂和鳌合剂，或简单作为一种抗阴离子剂（counteranion）（Johnston和Holwerda，1985）。此外，金属氯醌酸盐的颜色对金属－CA的结合模式是高度敏感的（Jeong和Holwerda，1989；Bessire等，1995）。又由于氯醌酸盐不是一种很强的络合剂（Martell等，2001），在良好络合的有机矿物质中，其结合配体不会被CA2－所替代，因而使特征性氯醌酸盐的红紫色基本上不发生变化。

　　这种比色快速测定设计目的是用于在稀释水溶液中主要是络合金属元素的铜、锌营养物质的鉴别。虽然络合在护送金属离子至吸收的生理学位点的过程中起着关键的作用，但要注意的是，在有机矿物质溶液中不可避免地存在一些游离金属离子，这是合理的（Holwerda，2001）。

快速测定的解释
　　在对快速测定进行解释的时候，每一样品的颜色需与预先准备好的空白对照小瓶颜色进行比较，空白对照为：在10 mL蒸馏水中加入3滴TEAC指示剂。将样品置于白色光前面进行观察，其颜色最易辨别。在记录上清夜的测定颜色之前，需要使深色的不溶物先行沉淀。以下所讲述的是典型的快速测定观察，并附有化学解释。

　　迅速形成橄榄绿（铜）或棕绿色（锌）沉淀，上清夜中无任何的紫色：溶解样品中的铜或锌大部分是非络合的（游离的）或者是非常轻度的络合。形成的固体物是Cu (CA) -2H2O或Zn (CA) -2H2O (Bottei和Green, 1968)。

　　无沉淀物形成，但是颜色由红紫色转变为蓝紫色：溶解样品中的铜或锌已很好络合，在平衡液中尚有少量浓度的未络合金属离子；氯醌酸盐能与金属离子相互作用，但是其它的结合配体阻止了Cu (CA) -2H2O或Zn (CA) -2H2O的形成和沉淀。

　　形成沉淀，上清夜中有少量紫色：在样品中存在相当浓度的络合和游离金属离子。
　　无沉淀物形成，而且指示剂颜色保持不变（红紫色）：溶解样品中的铜或锌已强有力和充分地络合或鳌合的，平衡液中仅含有非常少量浓度的未络合金属离子；氯冉酸盐完全没有与金属离子相互作用。

　　指示剂从紫色变为橙色：样品是强酸性的，仅含有非络合的金属离子；未溶解的氯醌酸使之转变为橙色。
　　一些其他类型的颜色变化或沉淀物产生：有可能出现其他的颜色变化，但有机矿物质样品似无这种可能。
　　蛋白质与指示剂也可能相互作用而形成不溶性盐（但仍为紫色）。在这种情况下，如果溶解的金属是良好络合的，那么紫色度会降低。在任何情况下，不要试图对以上未涉及的颜色变化进行解释。另外，还要高度注意：在某些情况下，这样一简单的测定可能出现非结论性的结果。

　　通过与现有成熟方法测定的络合及游离金属离子结果进行对比，可以证实指示剂快速测定方法的有效性。第二层次的验证是以快速测定的颜色与商业有售的铜锌营养物经电化学确定的组成系数间的相关为特征（Holwerda等, 1995和Holweda, 1997）。稳定性低的络合物，例如蛋氨酸锌和蛋氨酸铜，在滴加TEAC时产生不稳定的沉淀物，与快速分解成相应的游离金属离子相一致。相反，用极普法检测并显示出75％以上络合作用的有机矿物质，在快速测定中并不形成沉淀物，而且上清液的颜色与TEAC的空白对照相似。

快速测定的必备条件和局限性
　　比色快速测定是在非缓冲的水溶液中进行的，因此，样品可以与其在纯水中的溶解进行准确的比较。因而，不可能得到在生理条件下金属络合有效性的结论。由于样品未予以称重，而且也未测定浓度，因而无法得到溶液中络合或鳌合物百分率的定量结论。虽然快速测定提供了鉴别含有大部分游离金属离子样品的简易方法，但是仅按照比色法尚不能在简单的络合和鳌合之间予以区别。在TEAC检测中观察到的细微指示剂颜色差异，与氯醌酸盐结合金属离子的能力有关，但与其他的结合配体是否形成鳌合环无关。

　　为了使快速测定更为有效，总的金属溶解度应该等于或大于TEAC浓度。加入过量的指示剂或者金属溶解度很低，由于没有足量的金属离子与全部指示剂进行反应，将会产生假阳性的络合测定（保留其紫色）。因此快速测定仅应用于至少是中等溶解性的样品。高度不溶性的锌氧化物，是快速测定不能得出有意义结论的一个典型例子。

　　快速测定的局限性包括：1）背景色，可能会使测试结果模糊；2）二次反应，可能会使比色测定解释无效。一些有机矿物质溶解后成为深黄色或深棕色溶液，这些颜色反映了有机物的含量。如果固形物不能在推荐的30秒测定并观察颜色变化期间快速产生沉淀，那么在加入TEAC指示剂之前，离心清除这些不溶物将是必需的。当TEAC紫色更浓于有机铜的蓝色时，其背景铜的比色干扰是最小的。当测试样品瓶紧靠于白色光线观察时，有可能检测到大多数深黄色样品上清液中残存的紫色。

　　这种快速测定，对溶解释放良好络合金属离子的有机铜和有机锌产品的鉴别，是一种直观、价格低廉的比色方法。该测定适用于有机矿物质样品的现场测试，不需要专门的设备或训练。尽管定性测定用于鉴别游离和络合铜或锌源是高度有效的，但为了区别简单络合和鳌合则仍然需要更精密的方法。

译自：Feed International, October 2001。

供饲料实验室和质检人员应用的试剂准备和操作程步骤

　　微矿补充物中铜和锌络合度快速比色测定，所用的指示剂盐是冉氯酸三乙基铵（TEAC），之所以选择它的原因是由于其高水溶性、热稳定性和易于配制的特点。虽然TEAC尚未有商品销售，但是可以利用现有的廉价有机物前体——三乙铵和氯醌酸进行合成。

　　TEAC的制作：在200 mL甲醇中加入氯醌酸（52.25 g，0.250 mol）搅拌均匀，在烟雾罩内与三乙胺(100 mL, 72. 6 g, 0.717 moL) 混合。在混合时间内，橙色的氯醌酸就转变成紫色的TEAC产品。在蒸发甲醇和过量的三乙胺之后，将固体产品碾成细粉末。TEAC是一种无味的物质，在环境温度下可以长期贮存。分子式为[HN(C2H5)3]2(C6Cl2O4) = C18H32N2Cl2O4 (分子量 ＝ 411.37 g / moL)，产量102 g（99％）。

　　TEAC尚无现成的安全数据资料，因而建议参照氯醌酸（CAS no. 87-88-7）的安全指导。稀释的TEAC比色试剂无害无毒，若撒在手上或胳膊上，立即用清水冲洗即可。桌面上的溢出物应该使用吸水性好的一次性纸巾进行清理。

　　进行快速测定操作，操作人员只需要基本的实验室仪器，包括：抹刀、约37mL的旋盖小瓶、一次性的聚乙烯吸量管和废液瓶。所需的化学试剂包括：比色测试溶液（1.0 gTEAC溶于10 mL蒸馏水，室温贮存于深色瓶中）、蒸馏水、金属硫酸盐以及有机矿物元素样品。只要不暴露于高温或遭受太阳直射，TEAC指示剂溶液可以稳定保存数个月。

快速测定程序包括以下几个步骤：
1．取10 mL蒸馏水加入带塞子的试管中（大约一次性吸量管容积的3倍）；必须使用优质蒸馏水，因为自来水中存在的矿物质会对测试产生干扰；
2．使用抹刀取少量固体样品（约30 – 50 mg）加入试管中，塞紧盖子，振荡30秒以上直至样品全部溶解。样品不需要准确地称量，但是用量不足的话，将会导致测定结果无效；有些有机矿物质不能全部溶解，但是残留的固体一般不影响测试。在滴加TEAC之前，必须达到溶解平衡（solubility equilibrium）。样品振荡不均匀，比色反应将有误；
3．小心翼翼地向样品溶液中精确滴加3滴指示剂（TEAC）。轻轻摇晃确保完全混合，注意观察30秒后所形成的颜色。30秒内形成的颜色一般至少保持一个小时不变，但是在几分钟之内可能发生二次反应，逐渐改变上清液颜色。游离态或络合差的铜和锌离子的指示剂反应非常迅速，因此混合30秒后所形成的颜色为化学解释提供了一个公正、稳定的基础；
4．测定完全结束之后，将试管中的内容物转移到废液瓶中。样品与指示剂的混合废液不可以直接倒入下水道，请参照氯醌酸废弃处理的安全注意事项。使用蒸馏水洗净试管和塞子。

lcy0610

资料很棒！下载了学习！