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发表于 2009-8-3 17:10:40
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一、
盐霉素效价检测现有方法简介：
盐霉素效价检测使用的是微生物效价测定法中的管碟法，是利用微生物在特定培养基上的扩散作用，用已知效价的标准溶液与未知效价的样品溶液在含有短小芽孢杆菌的特定培养基上对照培养，根据产生抑菌圈的大小来计算样品的含量。
二、
课题选择
由于传统的微生物测定法耗时长、误差大，重现性差、成本高等诸多弊端，已不能满足现代化生产的需要，随着现代化生产的需要，随着中国加入世贸组织和企业进行FDA认证，企业面对的市场不仅仅是国内，而且还有国外市场，目前欧洲许多国家已不再使用微生物测定法测定药品的含量，而是改用先进的、更可信的HPLC法，因此为了提高检测的准确度，进一步完善盐霉素产品的质量控制标准，选择“高效液相检测盐霉素效价”。
三、
现状调查
1)
检测方法的调查 抑菌圈圆正及大小的影响
标准品与供试品不同质 药液的飞溅 培养基内有小凝块
培养基温度不均匀
器具被污染
含有影响抗菌活性 试剂中赋型剂的影响
培养基杂质
钢管底部不平滑
物标准品与供试品不同
缓冲液ph和盐浓度的影响
培养基温度、扩散
所用缓冲液不同
溶解所用溶剂不相同
批
系数、溶液浓度
方法误差
细菌生长时间不同 菌种分离纯化不及时
检定菌放置时间过长
检定菌 恒温室温度不稳定
2)
检测成本调查：生测法所使用的试剂多达10种以上，370恒温室耗电量大，所用玻璃器皿成本高，致使单批测量成本60元左右，工段月成本高达12000元。
3)
人员调查：岗位化验员虽有多年工作经验，但由于检测方法完全由手工操作，过程繁琐，工作量大，影响因素较多，易出现操作误差，且人员的工作效率较低。
4)
仪器调查：抑菌圈测定仪重复扫描，重现性差，误差在1-2％,致使同批样品精确度差不能确保有良好的准确度。
5)
试剂调查：所用试剂种类繁多，杂质含量高，影响扩散系数，从而造成测定结果不稳定。
6)
环境因素调查：因为被废弃的培养基内带有活的菌体，排放后对环境产生污染。
四、
活动目标
1)
使检测误差控制在5％以下，提高检测的准确度。
2)
减少劳动量，节省人员，降低单批测定的成本。
3)
避免带活菌体污物的排放，减少环境污染。
原因分析：降低检测偏差的可控因素进行分析。
降低偏差
| | 改变现有的检测方法
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| 降低成本
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| | 尽量减少手工操作
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| | 选用更为精密的仪器
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| | 加强岗位员工的培训
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| 菌丝
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| 杂菌的影响
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| Ph及盐浓度不合规定
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| 恒温室温度不稳定
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| 组分配不同
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| 物质不同
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| 赋型剂的影响
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| 鉴定菌的质量
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| 加热温度过高
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| 标准品与供试品不同质
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| 被污染
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| 杂质引起菌种扩散
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| 扩散系数
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| 操作人员技能
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| 试剂纯度
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| 理论知识薄弱
| | 操作不规范
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| 检测偏差大
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| 人员的主观意识
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改用新方法，以提高检测的准确度及稳定性，使误差控制在5％以下，并降低检测成本。
对上述找出的可控因素进行分析确认：
| | | | | | | 检测偏差超出5％
| 是
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| | | 重复测定误差在1-2％
| 是
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| | | 手工操作烦琐，失误较多
| 是
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| | | 杂质有可能对测定结果产生影响
| 否
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| | | 二者直线不平行，斜率不等
| 否
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| | | 试验操作误差
| 是
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| | | 影响抑菌圈的清晰度形成
| 否
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| | | 测定结果的稳定性
| 是
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| | | 影响抑菌圈的圈正和大小以及培养温度不稳定从而影响测定结果
| 是
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（一）我们对以上分析找出关键因素制定对策：
| | | | | | | 标准品与供试品不同
| 引起检测误差过大超过5%
| 寻找新的方法改变要因对测量结果的影响
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| | 扩散系数
| | 操作条件
| | 操作人员技术不稳定
| | 仪器的稳定性
| 稳定性差
| 选用更为先进的仪器
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| | 人员的主观意识和技能
| 理论知识及操作技能较差、习惯操作太多
| 加强培训、提高水平
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利用工段会的机会对岗位员工进行授课，培训HPL的理论及实际操作知识，使每位员工都能熟练掌握操作技能，改变习惯性操作，并符合GMP的规定，尽可能地减小操作偏差更好地服务生产，同时加大考核及抽检的力度，加强员工的责任心，从而督促每一位员工加强学习，不断提高干好本职工作。
七 对策实施：
针对检测方法中引起偏差的原因我们计划采用：药典及国际通用的HPLC法检测盐盐霉素含量，从而达到降低偏差、减少工作量、提高工作效率，增加数据可信度，提高产品质量信誉。查阅有关资料及文献，使用
**方法并对方法中的色谱条件进行论证
1.
固定条件：
确定设备条件：（Agilend1100高效液相色谱仪）表 、L18反相色谱柱、20ml定量环
2.
色谱条件的论证（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）流速0.6ml/min,柱温35℃、反应温度100℃、检测波长520nm。
（1）
流动相比：甲醇V：冰乙酸V：水V
制备配比为93：7：0.1、94：6：0.1、95：5：0.1、96：4：0.1、96.4：3.6：0.1、97：3：0.1六种流动相，发现流动相含量高时，灵敏度和峰面积都有较高的表现，但有没有分开的峰，有机相低时虽然所有的峰分离效果很好，但其响应却低，有机相含量在95－96%时较好的分离及响应值，选择配比95：5：0.1做为流动相配比。
（2）流动相流速的确定：流动相配比按95：5：0.1时选拔择流速，使用0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min七种流速发现流速低时响应值及分离度都有较好的表现，原因是因为流速低时，柱的反应能有充分的时间，但其峰形和出峰时间较差，流速高时峰形好但其响应及分离度不好，权衡利弊，确定流速为0.8ml/min为宜
（3）衍生剂浓度的探索，流动相配比（95：5：0.1）。流速为0.8ml/min.先用四种配比，甲醇v:香草w:浓硫酸v(95 :32:0.5,95:4:0.5,95:5:0.5,95:6;0.5)，香草浓度在4%以上时响应值和分离度较好，没有太大的改变。而浓度低时由于反应不会完全而响应值不高。再提高硫酸的浓度为0.6时。响应值更好，所以选择了95：4：0.6。
（4）反应池温度的探索，
固定条件：流动相配比为（958：5：0.1）流速为0.8ml/min.衍生剂配比为95：4：0.6，选择温度90oc,95 oc,100 oc,105 oc,110 oc,随着反应池温度的提高，响应值有所提高，峰型不受影响，但温度过高仪器受到的伤害较大，长期受高温对反应池也有腐蚀，不能长时间使用，选定100 oc时其响应值就能满足要求。
（5）柱温度的探索
固定条件：流动相配比为（95：5：0.1）流速为0.8ml/min,衍生配比95：5：0.6反应池温度为100 oc
改变柱温度分别为25oc,30 oc,35 oc,40 oc,45 oc,5种情况，发现只有出峰时间响应值有较小改变峰型基本上不变。由于温度过高可能导致固定相的长期流失引起柱效减低，故在常温下操作即可，柱温度确定为35 oc
（6）进样量的探索
固定条件：流动相配比为（95：5：0.1）流速为0.8ml/min,衍生剂（95：5：0.6）流速0.3 ml/min反应池温度为100 oc，柱温度35 oc
选用20μl的定量环，进样浓度为1000μ/ml,800μ/ml,500μ/ml,200μ/ml,100μ/ml,150μ/ml.发现进样量高时，峰的对称性不好，有可能引起超载，大大缩短色谱柱的寿命，进样量太少则引起相对误差较大，建议浓度为100μ/ml即为2μg
3最佳色谱条件的确定：
检测波长：520nm,流动相配比甲醇V：冰乙酸V:水V=95:5:0.1,流速0.8ml/min衍生剂配比（甲醇v:香草w:浓硫酸）95：4：0.6，衍生剂流速0.6ml/min，反应池温度100 oc，柱温度35 oc，进样量为2μg
流动相及衍生剂必须经过脱气防止气泡产生
4 样品提取，根据估计效价精确称取一定量的样品，用20ml的色谱极甲醇提取，浸泡30min ,震荡提取30min，过滤弃去初滤液，再取1ml至10ml容量瓶中定容得100μ/ml的样品用0.45μm的微孔滤膜过滤即可进样。
5 标准品的制备：精确称取50mg左右的标准品至50ml容量瓶中，用甲醇定容再分别吸取2.25ml，2.5 ml，2.75 ml的标准液至25 ml容量瓶中，即得10μ/ml，100μ/ml，110μ/ml的标准液做储备液，用来作曲线，用外标法测盐霉素含量。
八 效果检查：
1)
色普条件
C18反相色普柱（大连依利特）流动相（甲醇V：水V：冰V＝95.5：4.5：0.1），流速0.8ML/MIN,衍生剂（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）20UL定量环，柱温350c，反应池温度1000c，检测波长7MIN左右。
2）准确度
在已知含量的盐霉素粉剂和颗粒中添加一定量的对照品，再做添加后样品中盐霉素的含量。算得样品添加含量回收率如下表：
| 已知含量ug/mg
| 添加后含量ug/mg
| 回收量ug/mg
| 回收率％
| 平均回收率％
| F1
| 131.68
| 146.47
| 145.85
| 99.6
| 99.73
| F2
| 131.68
| 146.47
| 146.57
| 100.1
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| F3
| 131.68
| 146.67
| 145.85
| 99.6
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| K1
| 125.59
| 140.46
| 140.89
| 100
| 99.49
| K2
| 125.59
| 140.66
| 139.95
| 99.5
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| K3
| 125.59
| 143.51
| 142.05
| 98.98
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线性及线性范围
配制90u/ml, 95u/ml、 100u/ml、 110u/ml系列标准液,并利用面积作为响应值，作曲线得Area=3.34989Amt+1.3.278,相关系数r=0.9999,说明其在1.8ug-2.2ug之间具有良好的线性。
3)
精确度
对同一批粉剂和颗粒分别作三个平行样得结果如下表：
| 测得含量ug/mg
| 平均含量ug/mg
| RSD%
| 平均RSD%
| F1
| 131.04
| 131.68
| 0.5
| 0.6
| F2
| 132.53
|
| 0.6
|
| F3
| 131.49
|
| 0.7
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| K1
| 126.95
| 125.59
| 1.1
| 0.7
| K2
| 124.72
|
| 0.7
|
| K3
| 125.11
|
| 0.4
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样品稳定性
对同一样品进行放置一段时间测量，得如下数据，说明样品24小时之内具有良好的稳定性：
| 2h
| 4h
| 8h
| 20h
| 24h
| A
| 309
| 308
| 308
| 307
| 307
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重现性
对同一样品重复进样三次，所得数据如下表，说明此方法具有较好的重现性。
| 出峰时间
| 峰面积
| 峰高
| 峰宽
| | 7.109
| 304.0
| 27.7
| 0.1688
| | 7.125
| 304.4
| 28.0
| 0.1690
| | 7.131
| 303.0
| 27.8
| 0.1678
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置顶卡
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