在发酵的角度廓清“后抗生素时代”的含义

叶赫娜兰.孤城

这样，就可以在不同目标蛋白上表达系和发酵工艺上做出选择。如果是小分子，无糖基化修饰或不在体液中发挥作用的蛋白，可以选择大肠杆菌和酵母菌表达系，得到可溶性蛋白，然后提取。如果分子量合适，并对生产成本有诉求，而且可以比较方便的复性，则选用大肠杆菌表达系，得到包涵体，然后复性。如果是需要在体液中发挥活性并有糖基化要求的 蛋白，则选用经过分子生物学改造的酵母菌表达系。

叶赫娜兰.孤城

下面，以溶菌酶为例，阐述一下蛋白表达系的选择和工艺的确定。

溶菌酶是一类具有种属差异的非特异性免疫物质，在动物界中普遍存在，种类繁多，其实，在植物和微生物中也有发现。但研究最多的还是动物。开发兽用溶菌酶，主要是想作为抗生素的替代物，作为添加剂使用。因此是一个低附加值的产品。下面一切的工作，都会围绕“兽用”和“低附加值”展开。

首先，我们比较了几种常见和认为有效的溶菌酶，我们发现，杀菌效果最好的是人的溶菌酶，但考虑到潜在的危险（具有对人溶菌酶产生抗性，并使抗性基因扩散），我们舍尔求其次，用了鸟类蛋清溶菌酶，作为表达对象。

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然后，在得到溶菌酶蛋白的一级结构后，我们对此进行了分析。此蛋白不会用于体液内，故没有糖链修饰的问题。分子量不是很大，但也不太小，130左右的氨基酸构成，足以形成包涵体，这就为用大肠杆菌表达系高效表达提供了可能。讨厌的是有4个二硫键，其中有两个在结构复杂区域，折叠正确有一定的困难。但是，如果用酵母菌做，可能没法解决成本问题，即便优化工艺现在过去了，也不会是最终版本----肯定会有人用大肠杆菌做。所以，结论就是必须知难而进，拿下复性工艺。

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另外，由于是低附加值产品，发酵吨位就不能太小。以往分子生物学流行的50升，100升小罐发酵，肯定是不行的。发酵罐的放大，除了溶氧，剪切力发生变化，更重要的是搅拌线速度改变了胞外酶以及包括细胞本身的代谢方式和速度。在胞内体现就是氧化还原电势的改变，这在工艺上会带来很多麻烦。虽然说，一般是放大后产量往往提高，但放大过程中，小罐的经验就不能照搬了。同时，也因为是低附加值产品，发酵过程中诸如质粒丢失等稳定性要求，就很高了，应为只有稳定，才能控制成本。这样，工艺就成了第二个难点。

叶赫娜兰.孤城

明白这些之后，我们按照大肠杆菌的喜好，合成了溶菌酶的基因。然后构建质粒，导入细胞。在摇瓶水平表达溶菌酶。在筛选复性条件的同时，我们就同时在发酵罐水平对工艺稳定性进行了优化。

首先，为了进一步提高质粒稳定性，我们对初始培养基进行了重新设计。并改动发酵工艺策略，由于是胞内产物，我们应用高细胞密度发酵控制法延长限制性生长时间（不能用经典发酵的延长对数期生长时间的办法，对工程菌不适合，会造成质粒丢失，代谢紊乱等一系列问题），提高细胞量，并改变了诱导时机，得到了稳定的高产，具体数据比较枯燥，就不在此展开了。

叶赫娜兰.孤城

提取方面，经过不懈的努力，我们也掌握了比较成功的复性条件（具体由另外人员负责，也不做详细介绍了）。这样，工艺才基本拼凑好。进一步优化，在试生产多次重复时在进行。

以上，是外源蛋白表达的粗略的一个技术和工艺的过程。

叶赫娜兰-孤城 于 2009-6-2 09:10 补充以下内容

没人回，自己回。

很无聊的，但该补充的还是补充下，万一有人看呢？

还有两个表达系,也比较常用：乳酸菌和芽孢杆菌。都是细菌。

孟俊英

看过了，一气呵成。你的这些太专业了，我还要好好转化一下。:)3:畜牧微生物学虽然是畜牧业的一个重要分枝，但做酸奶、乳酪的工艺流程才是核心，不过溶菌酶的研发关乎今后的饲料养殖业发展，希望你坚持下去，同道会越来越多的。

叶赫娜兰.孤城

谢谢俊英君的鼓励。

现在还是有些困难的，真做工艺了，在设备扩大和选型，物料平衡等一些常规问题上，遇到阻力。--主要还是成本，在这个压力下，有可能重新回到工程菌构建上，重新设计构建方案，重新开始。

做抗生素出身，虽然作过研发和生产，对成本还是大意了。惭愧:liuhan:

好在是小试，损失还谈不上。嘿嘿。

东方龙

21世纪是基因工程的时代，我坚信这一天迟早要到来，基因工程，发酵工程，蛋白（酶）工程，细胞工程。真正意义上的分子时代

东方龙 于 2009-7-5 00:29 补充以下内容

溶菌酶也是好东西，我更坚信。因为我一直在坚持使用！！！！！！！！！

kltdzhong

随着技术的进步应该会代替抗生素吧。