博士论文：高效降解棉酚菌种的选育及棉籽饼粕生物发酵的研究

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内容介绍：摘要 棉籽饼粕富含蛋白质，是很好的植物蛋白饲料资源。但因其含有对动物有 毒的游离棉酚，其利用价值和使用量受到极大限制。为此，人们研究了许多脱 毒方法，如有机溶剂浸提、硫酸亚铁处理、氢氧化钙处理以及微生物发酵等方 法。这些方法在棉籽饼粕脱毒方面起到了重要作用，但有机溶剂浸提法存在有 机溶剂残留问题，对动物有潜在的危害;硫酸亚铁处理影响饲料品质和降低采 食量;氢氧化钙处理脱毒效率相对较低。微生物发酵法是一种有发展前景的方 法，该法不但能脱除棉籽饼粕中的棉酚，而且还可以提高棉籽饼粕的蛋白质含 量，发酵底物中存留许多酶类(微生物分泌，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂 解酶)、维生素、氨基酸以及一些促生长因子，因而受到了广泛重视。 本课题通过选育高效降解棉酚的菌株，优化发酵工艺参数，探讨影响发酵 脱毒效果的因素，考察复合发酵脱毒效果及其影响因素等途径来研究棉籽饼粕 生物发酵效果。 通过醋酸棉酚无糖查氏培养基和醋酸棉酚麦芽汁培养基平板筛选和培育技 术，并利用棉籽饼生物发酵的方法，选育出一株对棉酚具有较高脱毒率的菌种 热带假丝酵母ZD一3(CandidalropicalisZD一3)。热带假丝酵母ZD一3细胞呈卵圆 形，大小为3~4X4一5脚，出芽繁殖。用麦芽汁液体培养该菌，菌体沉淀于 管底。平板培养菌落有皱纹，可形成假菌丝。热带假丝酵母ZD一3不能在半厌 氧条件下发酵棉子糖以及在好氧条件下同化利用棉子糖，因此在利用该菌进行 棉籽饼发酵脱毒时，应注意可发酵糖类物质(如淀粉)的补充。在液体培养基 中，热带假丝酵母ZD一3用于研究的适宜取种时间为12~18h(对数生长期)。 利用热带假丝酵母ZD一3对棉籽饼进行固体发酵脱毒，通过对底物游离棉酚 含量的测定，优化其发酵工艺参数。优化试验结果表明，底物组成适宜比例为棉 籽饼70%、玉米粉20%、小麦鼓10%。棉籽饼发酵脱毒的最佳条件参数为:发酵 时间48h，发酵温度30℃，菌液接种量5%(v/w)，底物水分含量50%，自然pH值 利用热带假丝酵母ZD一3对不同因子处理的棉籽饼底物进行生物固体发酵， 然后测定发酵底物中游离棉酚(FG)、蛋白质含量等指标，探讨糖源、加热处 浙江大学博士学位论文2006.6摘要 理、尿素、硫酸亚铁、碳酸钠以及矿物质等因素对棉籽饼生物发酵脱毒效果的 影响。试验结果表明，棉籽饼底物冲加入不同的可发酵糖源，可显著提高脱毒 效率，其中淀粉效果最好，脱毒率高达91.91%;加热处理可显著降低FG含量， 有利于棉籽饼底物的发酵脱毒;但底物中添加尿素，可降低棉籽饼发酵脱毒率， 不利于热带假丝酵母ZD一3发酵脱毒;底物中添加硫酸亚铁、碳酸钠和复合矿 物质，可显著提高假丝酵母ZD一3对棉籽饼的发酵脱毒率，脱毒率分别高达 94.70%、93.96%以及96.67%。 棉籽饼底物中分别加入O、0.5%、1%、2%的乙醇胺或氯化胆碱，混合均匀， 然后进行热处理试验和微生物发酵试验。试验结果表明，棉籽饼底物中加入不 同比例的乙醇胺或氯化胆碱，不利于棉籽饼热处理脱毒和发酵脱毒。 通过测定发酵底物FG含量、底物蛋白酶活性(中性、碱性和酸性)和底 物菌量的方法研究氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂以及全脂大豆对发酵效果的影响。 试验结果表明，①在底物热处理条件下发酵，氯化胆碱、乙醇胺、卵磷脂和全 脂大豆均无促进发酵脱毒作用，除氯化胆碱外，均显著降低发酵脱毒效率;氯 化胆碱、乙醇胺和卵磷脂可极显著提高中性蛋白酶活性;氯化胆碱和卵磷脂可 极显著提高碱性蛋白酶活性;各处理因素均可极显著提高底物酸性蛋白酶活 性;各处理因素可极显著提高底物菌体含量，其中氯化胆碱效果最好。②在底 物非热处理条件下发酵，乙醇胺、卵磷脂和全脂大豆均无促进发酵脱毒作用， 且显著降低发酵脱毒效率，但氯化胆碱有促进发酵脱毒的趋势;卵磷脂和全脂 大豆可极显著提高中性蛋白酶活性;各处理因素可极显著提高底物碱性蛋白酶 活性，极显著降低底物酸性蛋白酶活性;氯化胆碱可极显著提高底物菌量，而 其它因素处理的底物菌量显著降低。③研究发现氯化胆碱对棉籽饼底物发酵脱 毒和底物营养价值有重要的意义，其底物蛋白酶活性高、菌量多。在底物非热 处理条件下发酵，低浓度氯化胆碱具有促进发酵脱毒的作用。 利用热带假丝酵母ZD一3和黑曲霉ZD一8对棉籽饼进行单菌及复合菌种发 酵，然后测定发酵底物中游离棉酚(FG)、粗纤维(CF)、粗脂肪(EE)、氨基 酸含量，体外法测定饲料蛋白质氨基酸消失率，用环境扫描电镜拍摄底物发酵 后的显微形态结构变化等研究复合发酵效果。试验结果表明，复合发酵可极显 著地降低棉籽饼底物游离棉酚含量，脱毒率为91.64%;棉籽饼底物粗蛋白、总

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