大环内酯类药物爱乐新体外抑制欧洲型和北美型蓝耳病毒的复制

登高远眺

大环内酯类药物爱乐新体外抑制欧洲型和北美型蓝耳病毒的复制


猪繁殖与呼吸综合征是一种对现代养猪生产具有重要经济意义的疾病—仅美国每年就造成了数亿美元的损失Neumann et al．，2005)。该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(蓝耳病病毒)，它是一种动脉炎病毒，主要在肺泡巨噬细胞内复制。该病可以感染各种年龄的猪只，但呼吸症状通常出现在青年猪。生殖症状见于后备母猪和经产母猪，表现为流产、木乃伊胎、产下不能正常发育的弱仔。在妊娠最后的三个月里，如果易感的怀孕母猪感染了蓝耳病毒将特别容易导致这些生殖症状。蓝耳病毒污染的精液可以将该病传染给母猪。
猪繁殖与呼吸综合征于l987年首次在美国报导，不久以后欧洲也出现该病。血清学调查表明加拿大的猪只在20世纪70年代感染此病(Rossow，1998)，在欧洲Wensvoort等首次分离到这种病毒(1991)，在美国由Collins等分离到(1992 0有意思的是美洲和欧洲分离株存在基因组和抗原性的差异。当进行氨基酸比对时，两个毒株病毒表面的主要糖蛋白的差异达到40％。所以将这种病毒分类为1型(欧洲型)和2型(美洲型)。为什么一个全新的病毒在两个大陆沿着不同的谱系进化?为什么它们又几乎在同一时间发病?这些问题都有待解决。Hanada等(2005)提出，这种病毒大概在上世纪80年代从其他物种感染到了猪体，而且直到现在这种病毒还在改变着它糖蛋白上的跨膜区以适应猪体。有报道称PRRSV在所有检测过的RNA病毒当中进化速度是最快的。在其他的动脉炎病毒中，鼠的乳酸脱氢酶增高症病毒和蓝耳病毒存在较近的亲缘关系。
这种病毒高突变率的原因就是在这两种类型的PRRSV存在巨大的基因和抗原性差异。Stadejek等(2002)报道了东欧的l型PRRSV毒株和其他的l型PRRSV之间的差别。根据早期的田间分离株研发的PRRSV疫苗初期证明很有效，但是野毒株的基因差异降低了疫苗效果。活疫苗可以减少野毒株造成的病毒血症，尽管还是可以从扁桃体分离出PRRSV。灭火苗似乎效果有限，即使被用来抵抗同源毒株的攻毒实验也效果欠佳(Zuckermann et al．，2007)。1型PRRSV疫苗不保护2型野毒的攻击(van Woensel et al．，l998 0疫苗株和野毒株的同时感染也是可能的。
替米考星可能有抗蓝耳病病毒的效果(Molitoret al．，2001，Benfield et al．，2002)。爱乐新是一种大环内酯类的抗生素，学名叫万乐霉素。以前发表的文献(Stuart et al．，2007)表明万乐霉素进入细胞并在胞内蓄积的速度比替米考星更快。泰乐菌素是另一种大环内酯类，它的胞内蓄积效果很差。本实验的目的就是研究这三种大环内酯类抗生素在体外抗PRRSV的效果。
1材料与方法
1．1细胞系
由英国的吉米·格雷博士赠送的MAl04细胞。在格拉斯哥培养基里添加10％的胎牛血清，100单位的青霉素(Invitrogen公司)和l00μg／mL的链霉素(Invitrogen公司)。
1．2蓝耳病病毒株
欧洲株(1型)，DV株(英特威公司)为市场上购买的疫苗株。将此毒株在MAl04细胞上进行扩繁培养。存贮培养的病毒滴度为l08空斑形成单位／毫升。美洲型(2型)毒株，VR2332(Benfield et al．，1992)，来自美国标准菌种库(ATCC。35℃下在MAl04细胞上扩繁病毒(按照菌种库的要求)存储培养物的滴度为5×107空斑形成单位／mL。
1.3大环内酯抗生素
由伊科动物保健公司提供的口服用爱乐新溶液。该商品含有抗生素万乐霉素。替米考星预混剂Pulmotil(含有250m9／mL的盐酸替米考星)和Tylan(含l9／g泰乐菌素)均购买自Elanc0动物保健公司。
1.4测定三种大环内酯类药物的抗蓝耳病效果

将105MAl04细胞在24孔板上培养。将24孔板在37℃下过夜培养。37℃下用不同浓度的大环内酯类抗生素处理4h时。在抗生素孵育的细胞里，用10空斑形成单位每个细胞的感染复数分别感染1型和2型蓝耳病毒。细胞在适合的温度下培养20h，然后用4％(体积比)的甲醛／盐酸盐缓冲液固定。用间接免疫荧光来测定感染情况。
1．5免疫荧光
在室温下用0．2％的Triton X—I00／PBS处理细胞5min以增加其渗透性。用单克隆抗体检测l型蓝耳病毒的核衣壳蛋白，单克隆抗体由瓦格宁根大学的Michael Kroese博士惠赠。2型蓝耳病毒用单克隆抗体2D6来检测病毒的核衣壳蛋白。抗体分别按1／10和1／500的比例溶解在0．2％胎牛血清的PBS中，在室温放置30min。将样品用PBS—NCS洗涤两次。第二抗体是羊抗鼠IgG，将其偶联到Alexa Flu—or 488(Invitrogen公司)，在室温条件下以l／1000的比例加入到PBS—NCS中，孵育30min。将样品用PBS—NCS洗涤2次。用含有DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚盐酸盐)的封固剂(Invitrogen公司)将培养板的盖子封闭在载板上，然后用共聚焦显微镜观察。所有的细胞都用DAPl染色，蓝耳病毒阳性的细胞用荧光染色。
1．6吖啶橙细胞染色
将105MAl04细胞接种培养到24孔板内。将24孔板在37。C下过夜。在不同的浓度下用大环内酯类抗生素处理细胞4h，或者不做处理。加水配制成2mol／L的吖啶橙储备样品(Invitrogen公司)并加到组织培养基内，达到最终浓度为20μmol／L。将细胞在室温下孵育lh，然后用PBS洗两次。移除培养板盖子后立刻放在载玻片上。用共聚焦显微镜来进行观察。在酸性的细胞区域(次级内体和溶酶体)不见绿色荧光，他们呈现红色荧光，对20个细胞内的红色荧光点进行计数，把它们的平均数量排列成图表。
2结果与分析
2．1大环内酯类的抗病毒效果
爱乐新和替米考星对1型蓝耳病毒感染的抑制效果。用爱乐新处理过的MAl04细胞减少了PRRSV抗原的表达。每次处理后，表达PRRSV抗原的细胞数仅仅是细胞总数的一部分。当使用爱乐新的浓度为0．1μg／mL的时候，l型蓝耳病的复制降低了将近50％。替米考星也有抗病毒作用，虽然在浓度为0．1μg／mL的时候并没有抑制效果，但是当浓度为lμg／mL的时候PRRSV阳性细胞数减少到了50％。当替米考星浓度为l0μg／mL细胞有毒性作用。泰乐菌素没有抗病毒作用，即使在浓度达到100μg／mL的时候也没有效果。
用爱乐新和替米考星将MAl04细胞在特定的浓度下处理4h，然后用l型PRRSV(DV株)感染，感染复数为10~20h后固定细胞，用间接免疫荧光检测病毒感染的细胞，绿色荧光为病毒的核衣壳蛋白，红色荧光为α一微管蛋白。
按前文的方法将MAl04细胞用抗生素处理并进行病毒感染。20h后固定细胞，用间接通过免疫荧光的方法来检测病毒核衣壳蛋白，以此来检测病毒感染的细胞。用DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚盐酸盐)将细胞核染色后计数，从而算出细胞感染率的百分比。
用2型PRRSV(美洲株)进行实验时也得到了相同的结果，在使用0．1μg／mL爱乐新的时候，可以将PRRSV阳性细胞的数量减少到约50％，爱乐新浓度为l0μg／mL的时候，PRRSV阳性细胞数降到了2％以下。替米考星浓度为lμg／mL的时候可以把PRRSV阳性细胞数降到约50％，泰乐菌素在浓度为lμg／mL的时候没有抑制蓝耳病病毒复制的功能。
MAl04细胞用抗生素处理，然后感染2型蓝耳病毒(VR一2332株)。20h后固定细胞，用间接免疫荧光的方法来检测病毒感染的细胞，DAPl细胞核染色后计算感染细胞的百分比。
2．2大环内酯类对内体pH值的影响
为了检测爱乐新抗病毒效果的机制，本文作者研究了爱乐新和其他大环内酯类药物是否对内体的pH值有影响。使用吖啶橙作为酸性细胞器的指示剂。

MAl04细胞中吖啶橙染色的次级内体／溶酶体的平均数如图4所示。使用泰乐菌素时，浓度达到100μg／mL的时候也不会减少经吖啶橙染色的次级内体数，但是在培养基中替米考星的浓度为1．0μg／mL的时候可以观察到吖啶橙染色的次级内体数有略微的减少。0．1μg／mL浓度的爱乐新少量的减少了酸|生内体的数量，单个细胞中，呈红色的次级内体／溶酶体的数量从73减少到了68。当爱乐新在培养基中的浓度为l．0μg／mL时就大大的减少了酸性内体的数量，每个细胞中酸性内体的数量仅为10。
用爱乐新、泰乐菌素、替米考星处理MAl04细胞，在特定的浓度下处理4h。然后用2μmol／L的吖啶橙处理lmin。将细胞样品用PBS洗下来放到载玻片上，然后用共聚焦显微镜进行观察。吖啶橙染色的细胞呈绿色荧光，而酸性的细胞器如次级内体／溶酶体呈红色荧光。按前文提到的方法用大环内酯类处理MAl04细胞，然后进行吖啶橙染色。对每个细胞中的红色荧光细胞器进行计数，算出在每组抗生素特定浓度下的平均值。

xxc1963

谢谢您宝贵的试验资料。请问泰乐菌素杀毒道理何在？？