【转帖】猪细小病毒的介绍

嗷嗷乖乖

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一类小DNA病毒，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，其危害主要表现为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。该病毒对理化因素有很强的抵抗力，广泛分布于世界各地并在大多数猪场呈地方性流行，严重地影响着养猪业的发展，该病的严重危害受到了国内外许多学者的关注，对PPV诊断方法及免疫防制的研究成为了热点之一。

猪细小病毒感染可依据临床症状和流行病学作出初步诊断，一般认为，如果仅妊娠猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常，同时有证据表明是传染性疾病时，则应考虑到PPV感染的可能，但进一步确诊必须进行实验室诊断。自1967年，Cartwright等首次报道PPV病以来，有关该病诊断方法的研究报告较多，从最初的病毒分离鉴定，到血凝及血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等免疫学方法，直到核酸探针、聚合酶链式反应等分子生物学技术应用到PPV病的诊断中。

病毒分离和鉴定用于诊断PPV感染的最大优点是结果准确可靠，可以作为最后确诊。用于分离PPV的病料，一般为流产或死产胎儿的脑、肾、肝、肺、睾丸、胎盘及肠系膜淋巴结等，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高。。虽然此方法是最准确的诊断方法，但是其费时费力，并且需要一定的技术条件和设备，另外，其感染力会随着胎儿死亡时间而降低从而限制了临床应用；红细胞凝集试验(HA)操作简便易行，且能进行快速、大量的诊断，但是其灵敏度低、特异性不强，只能作为辅助诊断方法。

血凝抑制(HI)试验是检测PPV抗体最常用的经典方法，一般采用试管法和微量法。利用HI试验检测人工感染PPV的猪，发现感染后5d即可检测到相应抗体，12~14d 抗体滴度高达1024~4096，并能持续多年检出抗体。待检血清进行HI试验时需要首先进行热灭活处理，然后再用红细胞吸附，以除去血清中的非特异性血凝素，进一步用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。目前，该方法在国内外已得到广泛应用。血清中和试验(SN)也是检测PPV抗体的方法之一，其原理是利用被检血清的抗体中和PPV，然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。SN的特异性比HI高，但是SN的操作较为复杂，首先要进行病毒感染力的测定，而PPV在低剂量时并不引起细胞病变，从而限制了该方法的使用。1988年，Hohdatsu等率先建立了PPV的ELISA诊断方法并用于检测PPV的血清抗体，我国姜永厚等(1997)建立了双抗体夹心ELISA用于检测PPV的抗原，可建立的ELISA诊断方法非特异性较强。邵振华、田海燕(中国兽药监察所)用滤纸采集猪血样，加入到预先用PPV抗原处理的微孔板小孔内，进行免疫间接过氧化物酶染色试验检测PPV抗体，在2-3h内即可观察结果。对比试验证实比HI敏感(高7.4%)，特异性更强。就操作过程而言，该方法比HI要简单，且具有采血方式新颖、送样方便以及抗原软板可随意剪取、不需要特殊的仪器设备等优点，但该方法中抗原的保存时间有限，因此限制了该方法的普及应用。王川庆(1996)等利用对流免疫电泳技术检测PPV抗原和抗体，在pH8.6、离子浓度为0.1mol/L、电流4mA的条件下，1~2h便可得出结果，而且抗原和血清不需做特殊处理，使用的是普通电泳仪和常规试剂，因此有一定的推广价值，但是与HA或HI相比，其敏感度偏低。何启盖等(1999)将在IBRS-2细胞上同步培养增殖的PPV经甲醛灭活后，用经硫酸铵沉淀、透析浓缩后的病毒液致敏乳胶建立了检测PPV抗体的乳胶凝集试验诊断方法。致敏的乳胶抗原与PPV阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒，而且与生理盐水、PBS、犊牛血清、猪瘟、衣原体、口蹄疫、伪狂犬病、弓形虫病及萎缩性鼻炎等阳性血清不出现凝集现象。用LAT和HI同时对203份血清进行检测，结果发现二者的阳性符合率为93.16%。乳胶凝集试验与HI相比，具有简便、快速、经济等优点，尤其适合于临床上的现场检测，被许多学者誉为“傻瓜技术”，因此具有良好的推广应用前景。该方法的不足之处在于它所检测的抗体主要是IgM，因此只能用于疾病的定性诊断，不能进行血清抗体滴度的监测。Rivera等(1986)利用固相免疫荧光技术(IBA)检测PPV的抗原和抗体获得成功，其具有特异、敏感、快速、检出率高的特点，是实验室进行病毒分离鉴定常用的方法。

单克隆抗体具有特异性强，效价高并可在体外大量制备等特点，已成功地用于许多疾病的诊断和治疗。Mengeling等1984年就研制出PPV的McAb并用于临床诊断。国内俞太尉和丘惠深(1993)用PPV7909株免疫Balb/c小鼠，融合其脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，筛选出4株分泌抗PPV单克隆抗体的杂交瘤细胞系(F1、E6、G9、D4)，用D4株分泌的单克隆抗体建立的ELISA和HI同时对70份血清进行检测，阳性符合率为97.5%。但二者相比，因该ELISA具有从加样到结果判定均可自动化，不需对被检血清进行处理，样本容量大等特点而更适合于PPV病的早期诊断和流行病学调查。而核酸探针技术是一种分子水平的检测技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，特别适用于疾病的早期诊断和类症鉴别诊断，是近二十年来应用较多的一项诊断技术。Krell等(1988)率先将核酸探针技术应用于PPV的诊断，他们将以PPV RF DNA酶切得来的3.0kb的DNA片段用放射性同位素标记后作为探针通过打点杂交检测培养细胞中的PPV。结果发现最低可检测0.1pg DNA。与HA的比较结果表明，该方法比HA敏感100倍以上。国内吴保成等(1992)对PPV RF DNA的Hind III和Pst I片段，进行生物素标记后用作探针进行斑点杂交。结果发现，该探针能检测到约100pg的PPV DNA。侯喜林等(1997)同样利用PPV DNA的Hind III和Pst I片段进行地高辛标记后用作探针检测PPV DNA，结果能与其自行分离的7株PPV毒株的DNA杂交，最低检出限量为40pg DNA。之后，他们又将该探针用于临床检测PPV感染获得成功(侯喜林等，1998)。地高辛标记探针与放射性标记探针相比具有相同的敏感性，并且克服了生物素标记探针敏感性差、背景深的特点，因此是探针标记中较为理想的方法。核酸探针技术用于PPV抗原的检测比HA试验敏感、特异性强，适宜于实验室进行PPV感染的诊断，但该方法的技术含量高，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。

1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（PCR），使人们梦寐以求的体外大量扩增核酸片段的愿望成为现实。之后，该技术应用到了疾病诊断方法中。Moliter等(1991)根据PPV基因组序列设计了一对引物，扩增VP2基因中158bp的片段，利用酶切和探针杂交证实了扩增产物的特异性，同时对四株PPV及CPV、PRV的扩增结果进一步证实了PCR反应的特异性，该方法至少可以检出100fg的PPV DNA，相当于1 PFU的PPV量。国内，赵俊龙等利用扩增PPV VP2基因中的445bp片段，使PCR诊断结果更易于判读，同时建立了PPV和PRV二联诊断方法。

综上所述，用于PPV感染的诊断方法很多，各种方法具有不同的优缺点，相对而言，目前应用较多的是HA和HI试验，这两种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。要得到病原学的确诊，则最好利用病毒分离鉴定方法，这时免疫荧光技术经常成为首选。其它血清学诊断方法则根据不同的实验室条件和情况选择应用。毋庸讳言，核酸探针和PCR诊断技术的应用将会越来越广，这两项技术尤其是PCR技术则是所有诊断技术中灵敏度最高的诊断方法。

PPV感染目前还没有有效的治疗方法，同其它许多病毒病的防制一样，该病也主要以免疫预防为主，由于PPV血清型单一及其高免疫原性，使得疫苗接种成为控制PPV感染的一种行之有效的方法,就其疫苗研究进展综述如下：

1 弱毒疫苗 最早发现和应用于临床的是PPV NADL-2弱毒株，该毒株是将PPV强毒在实验室利用细胞培养连续传代50次以上致弱的,分子生物学研究证实，该毒株的基因组比强毒株PPV NADL-8在VP2基因上少300bp。临床实验证实，血清学阴性的怀孕母猪口服或鼻内接种NADL-2株，尽管有病毒血症存在，却不引起胎儿感染；若将该毒株经子宫内接种，可引起胎儿感染，从而导致繁殖障碍。日本学者Fujisakl等将PPV野毒在猪肾细胞上低温(30°C)连续传54代，产生了HT变异株，该毒株接种猪后不产生病毒血症，但能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力。在此基础上，Akihiro等将HＴ株在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代，获得了安全性更好的HT-SK-C株，利用该毒株生产的弱毒疫苗已在日本商品化。我国学者对PPV弱毒苗也进行了研究，蒋玉雯等从广西初产母猪所产死胎脏器中，分离出一株PPV自然弱毒株。用该毒株接种PPV HI抗体阴性的4月龄猪和怀孕14-23天的后备母猪，结果不产生病毒血症，母猪分娩正常，所产小猪吃奶前HI抗体阴性。另外，免疫的怀孕母猪用强毒株攻击后49天剖杀，胎儿发育正常，胎心采血HI抗体阴性，取胎儿脏器进行组织培养也未分离出病毒，而对照猪攻毒后产生了病毒血症并导致繁殖障碍，从胎儿脏器中分离出PPV。尽管已有多株弱毒疫苗在临床上应用，但是由于PPV强毒株的大量存在，人们对病毒重组及弱毒返强的担心一直使弱毒苗的应用受到一定限制。

2 灭活疫苗

（1）单价灭活疫苗 自1976年国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报道，并于80年代在美国、澳大利亚、法国等国家普遍应用。在我国，潘雪珠等研制成功PPV灭活疫苗之后，韩孝成等、肖驰等、邬捷等、吕建强等也先后研制出PPV灭活疫苗。PPV灭活疫苗的研制中，应用的灭活剂有福尔马林、β-丙内酯（β-PL）、AEI（N-乙酰乙烯亚胺）以及BEI（二乙烯亚胺）等。Fujisaki用福尔马林灭活病毒制成的疫苗，免疫动物诱导产生了较高的抗体滴度，但保护效果不理想；潘雪珠比较了福尔马林和AEI的灭活效果，证实AEI优于福尔马林；Joo等用β-丙内酯灭活的疫苗，可使猪产生的抗体至少持续4个月以上。免疫佐剂是影响PPV灭活疫苗效果的重要因素，Moliter等比较了13种不同佐剂用于PPV灭活疫苗的效果，结果发现50%氢氧化铝胶，顺丁烯乙酰(EMA)、CP-20961(Avridin)，油水乳剂及dimethyl–

dioctadecyl –ammonium bromide (DDA)作佐剂的疫苗，均诱导猪产生了高滴度的抗体，而用油佐剂、SDS、L-121、氢氧化铝和油乳剂混合物、SDS和氢氧化铝混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前在PPV灭活苗的制备中，经常采用的佐剂是氢氧化铝和油水乳剂。

（2）灭活二联疫苗 PRV，PPV和JEV病均是引起母猪繁殖障碍的主要疾病，研制出灭活多联疫苗可以简化免疫程序，降低临床应激反应，适合规模化养猪业的发展趋势。Mengeling等将通过细胞培养增殖的PPV和PRV，用AEI在37℃灭活后混合，加入10%的Al(OH)3制成灭活二联疫苗用于免疫预防试验。16头后备母猪进行两次免疫，间隔期为2周，8头母猪在妊娠后9周用PRV攻击，8头母猪在妊娠后6周用PPV攻击，然后分别在第13周和12周宰杀，观察保护情况。结果发现，16头母猪均未发生繁殖障碍，从胎儿体内未检出PRV和PPV。对免疫母猪的血清学检测结果证实，经二次免疫后，母猪的PRV中和抗体和PPV HI抗体滴度，与采用单苗免疫的抗体水平相当或稍高，从而说明PRV—PPV灭活二联疫苗具有良好的免疫保护作用。井出诚弥等曾用PPV和JEV二种病毒的弱毒疫苗混合后免疫母猪，产生的PPV和JEV抗体水平分别与相应单苗的相同。国内邬捷等用PPV灭活苗与JEV灭活苗混合或同时免疫后备母猪均取得了满意的效果。姜天童等利用幼龄胎猪生产PPV、利用小鼠增殖JEV后，分别灭活制成灭活二联疫苗，通过二联苗和单联苗比较试验显示，二联苗与两种单苗免疫猪产生的PPV和JEV抗体水平无显著差异。以上试验均证实两种病毒抗原同时刺激机体没有相互干扰作用。

3 PPV疫苗的免疫程序 在早期的研究报告中，PPV疫苗的免疫均为间隔2-3周二次注射，随着疫苗生产工艺的改进，许多学者发现一次免疫注射也能达到良好的效果，免疫后的后备母猪在妊娠40d时用强毒攻击，可以获得完全保护。此外，Edwards等认为PPV疫苗只能用于没有母源抗体的猪，因为在田间条件下母源抗体可能在不同程度上干扰疫苗的效果。Paul等发现猪群在接种PPV灭活疫苗时，母源抗体水平低的猪与血清学阴性猪的免疫应答完全一样，而中等水平的母源抗体对疫苗免疫有轻微干扰作用，高效价抗体对疫苗有明显干扰作用。吕建强等进行了PPV母源抗体对灭活疫苗免疫效果影响的研究，结果证实不论母源抗体水平高低均不会明显抑制疫苗的主动免疫反应，但是具有低效价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律，与具有高效价母源抗体猪的主动免疫抗体反应规律不同。在母源抗体滴度大于1:149.5时，灭活疫苗接种后抗体水平先降低然后上升，升幅只有1-3倍；而母源抗体小于1:25.6时，主动免疫抗体持续上升，母源抗体阴性的猪抗体增幅最大。根据PPV的流行病学特点，仔猪吃奶后2-3天即可在血液中检测到母源抗体，并于8-14天达到高峰，母源抗体可持续20-24周，因此PPV疫苗的免疫接种时间应选择在20周左右。建议，于配种前一个月、半个月各免疫一次。

4 新型疫苗展望 尽管PPV的弱毒苗和灭活苗在猪细小病毒病的预防控制中起到了十分重要的作用，但是各种疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗发生重组及毒力返强的潜在威胁，以及灭活疫苗免疫效果不稳定等。因此，寻找和发展更为安全有效的疫苗一直是猪细小病毒病免疫预防研究的主题。

（1）基因工程亚单位疫苗 Martinez等将PPV VP2基因克隆到杆状病毒表达系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表达的VP2多肽能自我装配成类病毒粒子(Virus-Like Particles，VLPs)，用其免疫母猪能诱导产生免疫应答。尽管未见有关该种疫苗进一步研究和应用的报导，但是VP2基因在体外表达的蛋白能自我包装成类病毒粒子的特性，为重组多价亚单位疫苗的研究打下了基础。

（2）基因工程多价亚单位疫苗 Sedlik等将PPV VP2和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体PACYM，转染表达PPV：VP2-LCMV蛋白，利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的CTL反应，在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。之后，Sedlik又将LCMV的CD8+ T细胞抗原决定簇多肽共价结合于1mm的脂质微球上，与上述表达的PPV：VP2-LCMV蛋白一起进行了免疫小鼠的比较，结果发现二者都能诱导产生很强的CD8+ T细胞反应。但是PPV：VP2-LCMV携带的抗原量比脂质体微球少100倍时，诱导的CTL活性仍比脂质体微球诱导的CTL活性高6倍，并且只有PPV：VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒HBSAg的抗原决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生了很强的针对插入的HBSAg决定簇的T细胞反应，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻击。这些结果均说明PPV VP2类病毒粒子，作为一种抗原的转运载体具有很大的潜在价值，并为进行多价重组疫苗的研究创造了良好的条件。

PRV和PPV在临床上经常混合感染的现象已有报导，因此研制出这二种病毒的重组疫苗对生产实践也具有重要意义。PRV属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的猪疱疹病毒I型，该病毒基因组是双链线状的DNA，大小约为150Kbp，含有多个可缺失的非必需基因，插入外源基因容量可达20Kbp，易于进行基因操作，因此具有作为病毒载体的必要条件。迄今为止，国内外用PRV作基因表达载体已成功表达了10多种外源目的基因。如Zijl等最早实现了病原保护性抗原基因在伪狂犬病毒中的表达，他们将猪瘟病毒（HCV）的囊膜蛋白基因E1插入到gG启动子的下游，构建了几株表达E1的重组伪狂犬病毒；将这些重组病毒进行动物试验，结果接种重组病毒的猪均能产生对HCV、PRV的高滴度中和抗体，并可保护猪免受PRV、HCV的强毒攻击。国内,王家富等构建了携带猪瘟病毒E2基因的重组伪狂犬病毒。但是上述研究所用载体均为PRV弱毒株，人们对其安全性仍有担心。为些，我们实验室近年来成功地研制出PRV的TK-/gG-/LacZ+ 疫苗株，该毒株缺失了PRV的毒力基因（TK），并有LacZ+标志基因作为筛选标志，以供重组筛选，因而成为更为理想的重组病毒载体。鉴于PPV VP2基因的良好免疫原性，将其插入到PRV载体中，有望研制出理想的PPV—PRV二价重组基因工程疫苗。

（3）基因疫苗 基因免疫又称核酸免疫，是由Wolff和Felgner于1990年偶然发现的，直接将编码有目的蛋白基因和表达调控序列的DNA或RNA注射到动物机体内，利用机体的转录和翻译系统，合成目的蛋白质，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。这种能够在体内表达外源蛋白，刺激机体产生免疫应答的核酸称为核酸疫苗，包括DNA和RNA疫苗。由于基因疫苗具有易于构建和改造，规模化生产成本低廉，具有良好的热稳定性、可诱导机体产生全面的免疫应答，故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，并被称作是“疫苗的第三次革命”。在1994年的世界卫生组织会议上，与会专家一致认为核酸疫苗将成为疾病防治中的又一个重要手段，特别是它将在一种疫苗预防多种疾病方面发挥作用。尽管对核酸疫苗进行了理论和应用方面的详细探讨，但是其作用机理目前尚未阐明。理论上认为，迄今所有用于主动免疫的第一、二代疫苗都可完善成效果更加理想的核酸疫苗。赵俊龙等进行了有关PPV核酸疫苗的研究，动物试验初步表明，以PPV结构基因VP1和VP2分别构建的核酸疫苗，均能诱导产生较高水平的体液免疫和细胞免疫，比常规灭活疫苗产生的高。核酸疫苗的生产简便、成本低廉，也预示着其具有理想的应用前景。（未发表）

（4）转基因植物可饲(食)疫苗 转基因植物可饲(食)疫苗是在二十世纪八十年代，利用植物基因工程技术创造转基因植物的基础上发展起来的。首先进行转基因植物可饲疫苗研究的是Curtiss和Cardineau，他们以专利的形式发表了他们的第一篇报告。Mason等报道了在转基因植物中表达乙肝表面抗原，提出转基因植物疫苗的概念，他们在研究HBSAg在转基因植物中表达时，发现外源基因在转基因植物中的转录和翻译没有受到限制，不仅可以正常编码蛋白，而且可以组装形成类病毒颗粒。正是基于这一点，我们认为有望开发出PPV转基因植物可饲疫苗，因为PPV的VP2基因表达后能自我形成类病毒粒子，这对保持其免疫原性是非常重要的；另外，VP2基因表达的类病毒粒子可以作为其它抗原的转运载体，这为开发多价的转基因植物疫苗提供了条件。