中药复方体外药理研究思考

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刘成海

摘　要：回顾近年来国内外中药复方体外实验研究进展，结合个人工作体会，对中药复方体外药理研究方法、存在问题与发展展望初步综述与思考。提出要加强中药复方研究体外研究，需提高受试药物质量控制；一分为二看待药物直接或含药血清间接添加的试验方法，两者宜共同发展相互补充；注意细胞模型的合适性，宜药物的细胞毒理与药理相结合、先进与基础指标相结合，谨慎推理结论；充分发挥体外实验快速、敏感、特异、易控等特点，复方整体与单味成分、化学物质与药效功能结合研究，以阐明复方的药理机制与物质基础，提高复方药理研究水平。
关键词：@中药复方/药理学；体外
分类号：R285.5　　　文献标识码：A
文章编号：1003-9783(2000)01-0053-04▲

　　体外药理研究具有快捷迅速、敏感特异、条件易控等优点，在药物的活性筛选、毒性评价与深入的细胞分子药理等研究中起重要作用［1］。随着细胞生物学与生化学技术的不断发展，体外药理研究方法日新月异，使得人们能够更加快速、准确、深刻地认识药物的毒理与药理。复方研究借鉴现代药理方法，体外试验日益增多，取得了许多进展，如日本小柴胡汤防治肝病的系列药理研究。但是由于中药成分复杂，我国复方体外药理研究基础较薄弱，需要在实践中不断发展提高。

1　日本近期小柴胡汤体外药理研究的特点

　　慢性肝炎目前尚缺乏特效药物，日本的慢性肝炎尤其是丙型肝炎发病较高，在临床治疗中广泛采用小柴胡汤，疗效显著，一些学者就其抗肝损伤与抗肝纤维化的作用机理进行了系统研究，近 10 年来，Medline 收录相关论文 136 篇，部分发表于核心刊物如 Hepatology［2，3］，引起国际肝病学界的关注［4］。
　　这些研究大都采用了体外试验，有以下几个特点：a.测定复方中每单味生药的主要成分含量，全方质控明确；b.全方或单味药经提取制备为药物粉末，测定其主要成分含量，并分离可能的数种主要药效成分；将全方与单味药的粗提物、单体成分直接温育培养细胞，进行全方的量效观察，以及全方、单味药与单体成分的药效比较；c.紧扣疾病病理，阐明主要药理机制。如肝纤维化病理关键在于过氧化等引起的肝星状细胞活化。围绕该病理，发现小柴胡汤重要作用机制之一在于抗氧化；d.通过对主要药效指标的比较观察，发现该方的主要活性成分是黄芩甙与黄芩甙元，这些物质与既往所发现的抗肝纤维化成分-水飞蓟素、槲皮素有相似结构，均为黄酮类，提示有可能由此发现一类抗肝纤维化新药。

2　加强成分分析与制备工艺，提高受试药物质量控制

　　受试药物质量的稳定是药效稳定的前提与基础。体外试验反应灵敏，如果复方成分含量变化过大，则药效重复性差，难以准确地反映其药理机制，也无法阐明其物质基础。受试药物的质控包括药材与制备工艺两个方面。药材的质控内容较多，包括种属、产地、药用部位、采收加工与鉴定检查等，其中成分含量测定是核心。虽然中药成分繁多，含量低微，检测困难，但是这些化学物质成分是决定药效的重要物质基础，体外试验用量少，敏感性强，成分含量的相对稳定对于体外药效实验重复稳定性具有重大意义。尽管难以弄清楚每一种成分，但应尽可能对复方中各药物的主要成分建立检测质控标准。且制备工艺必须稳定，尽量“纯化”复方粗提物，减少杂质等的影响。

3　添加方法选择与血清药理学界定

　　对于复方中药，是粗提物直接添加还是制成含药血清间接添加，已有报道［5，6］。80 年代曾见小柴胡汤等方药的血清药理研究，可是近来声音渐微，但 90 年代传入我国后却在国内兴盛起来，对方法学以及采用该方法进行药理学研究的报道日渐增多［7］。有的学者对此寄予厚望，认为不仅可进行药效学研究，也可进行复方血清药化学与药动学研究，血清药理学将成为一门新型分支学科。
　　归纳起来，大致认为直接添加有三方面缺点：a.缺乏复方的体内代谢物或机体反应物等实际有效成分，引起假阴性；b.机体非吸收物质的体外作用，造成假阳性；c.粗提物理化性质如杂质、酸碱度、渗透压、pH 值等对离体系的干扰。而含药血清法具有两大优势：a.体现复方药物的体内生化转化效应；b.克服药物本身理化性质对实验的直接干扰。
　　虽然应用血清药理学方法在复方药理研究中取得了一些积极进展，但是，该方法究竟是不是中药复方最佳的体外试验方法，发展前景如何?这些问题尚需进一步讨论与实践发展的检验。虽然直接添加法存在诸多缺点，但可以较好地控制受试药物主要成分质量，较稳定地进行药物量效观察，较方便地进行体外毒理药理研究，易于重复。临床上中药多为水煎口服，水溶性物质多为主要有效成分［8］，因此离体系统中溶于水的粗提物也是可以反应复方药效的，而一些理化干扰因素是可以避免的，如杂质的去除、酸碱度与渗透压的调整等，而且随超细粉末等新技术的发展应用，粗提物质量可进一步提高，干扰进一步减少。而药物血清材料可来自各种不同生理病理状态的个体，会出现含药血清差异；而且经过体内反应，药物含量进一步被稀释，成分更加复杂，增加了质控难度。血清中部分物质已是药物作用机体细胞的反应，如果细胞存在反馈机制，血清二次重复作用于细胞，将可能掩盖药物血清的实际作用。含药血清对离体系统同样也有干扰，如血清本身对体外酶活性的影响等。关于药物血清添加法与粗提物直接添加的优劣比较及与整体药效学的相关性，目前尚无严格统计学意义上的研究。药物血清学技术标准化与规范化也尚未建立，目前还难以确证两种方法孰优孰劣，含药血清与在体实验是否有相关一致。
　　我们及其他一些单位采用两种添加方法进行试验［9，10］，其结果有相似性。理论上固然可以从有效含药血清中分离成分，研究复方物质基础，但血清中中药成分含量低微，加上血清本身干扰，分析难度加大。通过复方成分逐步有机分解结合药物筛选，也同样可以较好阐明其物质基础。无论何种添加，都只是一种方法，目的在于明确药物的作用机制。血清药理学有长处，目前研究较热，但有局限性，作为一种尚不成熟的实验方法，还需要发展完善［11，12］；直接添加法同样也能反映药效，通过不断改进提取纯化技术，可逐步克服自身缺点，对其似乎不宜过早下否定的结论。对两种方法应实事求是辩证看待，相互补充，共同发展。

4　合理选择受试对象与检测指标，谨慎解释实验结果

　　与体内试验相比，体外试验有其特殊性。对受试对象多为培养细胞的离体系而言，以下几个方面值得注意。
4.1　细胞模型　首先要考虑针对性与简便性。药理研究当然要选择与疾病发生密切相关的细胞，如抗肿瘤药物选用肿瘤细胞。但药物是否对所选细胞相对特异有效?可增加试验细胞种类，进行比较。细胞类型甚多，实验难易程度相差很大。对预初试验与复杂条件的摸索，可用性质相近来源方便的细胞株代替。例如用成纤维细胞株代替肝星状细胞，观察抗肝纤维化含药血清的诸多因素影响，建立某些指标检测方法等。其次要考虑受试细胞的病理生理状态，有的细胞在体外基本是正常生长，不具备病理意义，药物的作用可能是细胞毒性。而药理研究在于观察药物对病理过程的干预，因此需要造模，在细胞分离前体内或分离后体外予以一定因素诱导。如欲观察药物对肝细胞损伤的影响，可加四氯化碳或乙醇刺激等。另外要考虑细胞体外生长规律，以确定最佳用药时间与细胞密度。培养细胞往往有密度抑制的特性，一般药物作用于指数分裂期或前期可较好地反映药效［13］，而控制细胞密度可满足不同实验要求［14］。如细胞 60%～75% 融合，可观察急性毒性，而降低密度并延长药物作用时间，可观察慢性毒性影响。
4.2　细胞毒性　化学成分通过细胞毒性试验，估算 ID50等数值，对评价药物毒性，指导实验或临床用量等有十分重要意义。复方中药细胞毒性怎样?以含药血清方式添加会发生什么改变?怎样借鉴化学成分细胞毒性研究方法评价复方毒性?尚需探讨。细胞终点毒性指标较多，如乳酸脱氢酶活性、［3H］亮氨酸掺入、线粒体 MTT 转化等，测定均较简便易行。虽然复方中药及其含药血清复杂，未知因素较多，开始较难做到准确的 ID50 等测定，但结合形态观察与生化检测对于大致观察细胞毒性及更好了解药理是有益的。
4.3　指标选择与结果解释　尽量采用新方法与新技术，从细胞分子乃至基因调控等水平阐明中药的作用机理，是体外实验的优势与目的。但是中药的复杂性可影响敏感的体外药效的稳定性，对基础关键性指标应从多个方法学角度观察并重复验证，增强可信性。一种细胞学生物功能常有多个反映指标，例如，对于细胞胶原蛋白生成量，通过细胞化学染色与图像分析可直观半定量观察原位沉积，ELISA 法可定量分析Ⅰ型等胶原的含量，而通过同位素标记掺入与胶原酶消化可测定其胶原生成率，这样综合不同角度的指标可得出较可信的结论。而一项指标可反映细胞多种功能变化，例如现在多用 MTT 法所反映的活细胞数量来判断药物的增殖影响，但这种细胞数量受多种因素影响。如细胞数量减少不仅反映增殖抑制，也可能是凋亡或毒性死亡增强。需增加观察指标，如［3H］TdR 掺入所反映的 DNA 合成，可解决问题。此外体外实验敏感性强，与体内实验有差异［1］。而中药成分复杂，影响因素多；受试细胞不同病理生理状态也有不同影响，因此结论宜慎重，需全面考虑，归纳多方资料而作出。

5　整体复方与部分成分、物质基础与药理机制相结合研究

　　复杂的中药复方理论上可以从不同层次分解为每一清楚的组成部分，即单味药及其化学成分，但复方却不是这些组成部分的机械组合，而是一个复杂的有机体系。研究发现［15，16］，全方在成分与药效上都不等于单味药的机械总和。从辩证角度看，作为全方的“整体”与构成这个整体的“部分”—单味药及其成分是复方中对立统一的两个方面，符合“系统与要素”的范畴。要素(单味药及其成分)之间相互联系与作用，形成配伍关系，构成系统整体(全方)，产生系统质。这种系统质表现为“结构与性能”两个方面，诸要素有机组成为系统全方的内部结构(物质基础)，并决定其外在性能(药效)表现。因而研究复方可从“系统与要素”、“结构与性能”两对范畴中去把握。对于药效作用，不能局限于整体复方，应深入分析各种要素的作用及其相互关系；也不能仅局限于复方的外部性能认识，可结合组成成分的药效与成分分析，认识决定这些药效性能的内在物质基础，这样才能深刻全面地把握复方药物的作用机制。
　　方法上，可以有目的地分离部分主要化学成分，与全方比较主要药效作用，从而发现主要药效成分，如上所举的小柴胡汤的研究工作。这种方法目的选择性较强，工作量相对较小，容易操作；但是忽视了方药合煎的作用，成分的主观选择容易造成遗漏，而且忽视了成分之间的相互作用。另一方法，是以主要药效指标为指引，先复方正交实验，了解主要药效药物及其配伍关系；而后对复方进行逐步植化分离，对每一步分离物都进行药效观察，追踪活性部位，逐层深入，可望阐明复方的物质基础与作用机理［17］。这些工作均涉及药效观察，药理模型是其关键，如果采用整体动物模型，工作量将十分庞大。因而需要建立合适的体外模型，充分发挥体外试验周期短、用量少的特点，进行大量的药物活性试验。
　　中药复方是中医辨证论治理论精髓的具体体现，复方研究是中医药现代化研究的重点与难点之一。我国近年来复方体外药理研究取得了许多进展，但与化学药物和国外某些复方药理研究相比有较大差距。需要我们进一步解放思想，实事求是，既要敢于突破传统方法，也不可照搬他人办法，需根据中医药的实际，围绕“作用机理与物质基础”之目标，药理与植化相结合，在充分开展临床与体内药理研究的同时，也大力加强复方体外实验研究，以提高复方研究水平。

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