三聚氰胺的各种检测方法

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采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测

本实验方案采用Thermo Scientific的Multiskan MK3型酶标仪和Wellwash 4MK2型洗板机，结合Abraxis三聚氰胺检测试剂盒（由北京测迪科技有限公司提供），以竞争法测抗原的原理对液态奶或奶粉中的三聚氰胺进行检测分析。

一、样品准备

巴氏消毒全脂奶（液体）：
1）用稀释液以1:10的比例稀释牛奶样品，如在900 μl的稀释液中加入100 μl牛奶。
婴幼儿配方奶粉：
1）按照配方奶粉的说明，以稀释液溶解奶粉，如用60 ml稀释液溶解8.6克奶粉。
2）用稀释液以1:5的比例稀释奶粉溶液

二、样品检测

1）试剂使用前，应使其温度恢复至室温（25±2℃）
2）吸取100 μl标准品（0, 20, 50, 100, 200和500 ppb）和准备好的样品加入相应的微孔中。然后，每孔再加入50 μl的三聚氰胺HRP酶标记物。
3）利用MK3酶标仪的振荡功能，振板60秒，并在室温下孵育30分钟。
4）孵育完后，将微孔板转移到Wellwash 4MK2洗板机上进行洗板，每孔加250 μl洗液，洗板四次。
5）每孔加入100 μl显色底物溶液，避光孵育20分钟。
6）每孔加入100 μl终止液，终止显色反应。
7）在MK3酶标仪上读板，测量波长450nm。

三、结果分析

1）以浓度为0 ppb标准品的吸光值为基准（B0），归一化标准品的检测吸光值B/B0（B指除B0以外的标准品吸光值）。
2）绘制以标准品的B/B0为Y轴坐标、对应的标准品浓度为X轴坐标的散点图。
3）对该散点图进行直线拟合。以该拟合曲线的直线方程对待测样品浓度进行计算。
4）如果样品吸光值大于最小标样的吸光值，则该样品的浓度＜20 ppb；如果样品吸光值小于最大标样的吸光值，则样品的浓度＞500 ppb。
5）结合稀释倍数，计算最终液态奶或奶粉中的三聚氰胺浓度，如液态奶稀释倍数是10倍。

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高效液相色谱- 二极管阵列法测定
高蛋白食品中的三聚氰胺
Determination of melamine in high p rotein food by high
performance liquid chromatography2photodiode array detector
汪　辉   曹小彦   彭新凯 陈利国 黄　辉   谭　舸
(长沙市食品质量安全监督检测中心,湖南长沙　410013)
(Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety, Changsha, Hunan 410012, China)
摘要:建立用高效液相色谱- 二极管阵列法测定高蛋白食品
中的三聚氰胺的检测方法。对不同样品采用不同的前处理
方法,然后用Agilent TC2C18 4. 6 ×250 mm色谱柱,柱温为
40 ℃,流动相为0. 02 mol/L硫酸铵∶甲醇= 94 ∶6 (V ∶V) ,
流速0. 8 mL /min,二极管阵列检测器于235 nm 波长下进行
检测,并以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定性,外
标法定量。不同样品的加标回收率为98. 8% ～101. 5% ,
RSD小于1. 2%。方法线性范围为0. 1～150μg/mL,检测限
为0. 01μg/mL,相关系数R = 0. 999 9。
关键词:高效液相色谱;二极管阵列检测器;三聚氰胺;高蛋
白食品
Abstract:A high performance liquid chromatography2 photodiode array
detector for determining the content of melamine in high p rotein food was
studied. In this paper, different p re2treatments were used in different
samp les. A Agilent TC2C18 column was used with methanol and
0. 02 mol/L ammonium sulfate (94 ∶6, V ∶V) asmobile phase. The flow
rate was 0. 8 mL /min. A diode array detectorwas used and the detection
wavelength was 235 nm. Qualitative analysiswas performed with retention
time and DAD spectrum similarity index value and quantitative analysis
was performed with external standard method. The calibration curve was
linear over a range from 0. 1μg/mL to 150. 0μg/mL. The lowest detected
limit was 0. 01mg/kg. The recoveries of different samp les were from
98. 8% to 101. 5% and relative standard deviationswere less than 1. 0%
( n = 10) . The linearity was 0. 1 to 150μg/mL, detection limit of mela2
mine was 0. 01μg/mL and related coefficient was 0. 999 9.
Keywords:High performance liquid chromatogra phy; Photodiode array
detector;Melamine; High p rotein food
最近美国发生了许多猫狗宠物非正常死亡事件。美国
FDA经过调查确认是宠物食品的原料受非法添加的三聚氰
胺污染。含三聚氰胺的食物被动物食用后,可以使动物发生
肾衰竭并导致死亡。三聚氰胺(Melamine)即蜜胺,又称氰尿
酰胺,是一种白色晶体,熔点354 ℃,难溶于水、乙二醇、甘油
和吡啶,略溶于乙醇,不溶于乙醚、苯和四氯化碳[ 1 ] 。按常规
三聚氰胺不可能通过环境污染的方式进入食品原料中。通
常三聚氰胺只作为生产塑料树脂的原料,其分子中含有大量
氮元素(见图1) ,
不法分子在植物蛋白添加三聚氰胺,是因
为其分子中含氮量高达66. 7%。非法添加化工原料三聚氰
胺可以提高含氮量,冒充成高蛋白食品,从而大幅度降低成
本。用“凯氏定氮法”测饲料和食品中的粗蛋白质的含
量[ 2 ] ,其实只是测氮的含量,再根据蛋白质的含氮量(15% ～
17% )折算成蛋白质。因此,通常情况下根本不能区分这种
“伪蛋白氮”。三聚氰胺在高温下可能分解产生氰化物(有
较大毒性) ,故应避免高温。

图1　三聚氰胺的结构式
目前国内外测定食品中三聚氰胺含量的方法很少,一般
采用气相- 质谱法[ 3 ]、液相- 质谱法、液相色谱法[ 4, 5 ]等。本
试验避开毒性大的乙腈,以甲醇和0. 02 mol/L硫酸铵作为流
动相,甲醇提取样品,吹干后20%的甲醇水溶解并定容,进
样,用二极管阵列检测器检测,结果令人满意。
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1　试验材料与方法
1. 1　仪器与试剂
Waters1525高液相色谱仪:配2996二极管阵列检测器、
717Plus自动进样器、Epower工作站;
超纯水处理器:北京东西电子有限公司;
超声清洗器:天津奥特赛恩斯仪器有限公司;
氮吹仪:天津市恒皇科技发展有限公司;
三聚氰胺(99 + % ) : SINGMA2ALDR ICH. INC;
硫酸铵(分析纯) :上海试剂四厂;
甲醇(色谱纯) :国药集团化学试剂有限公司。
1. 2　色谱条件
色谱柱为Agilent TC2C18 色谱柱( 250 mm ×4. 6 mm,
5μm i. d. ) ;柱温为40 ℃;流速为0. 8 mL /min;流动相为硫
酸铵(0. 02 mol/L ) ∶甲醇= 94 ∶6 (V ∶V) ; 检测波长为
235 nm;进样量10 mL[ 6 ]。
1. 3　标准溶液的制备
精密称取三聚氰胺对照品25. 0 mg 于100 mL 容量瓶
中,加20%的甲醇水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 使成为
250μg/mL的标准储备液。精密吸取三聚氰胺标准储备溶液
0. 5, 1. 0, 2. 0, 5. 0, 10. 0 mL,分别置于25 mL 容量瓶中,加
20%的甲醇水稀释至刻度,摇匀,使成为浓度为5, 10, 20, 50,
100μg/mL标准使用液,经0. 45μm的滤膜过滤,按色谱条件
进行分析测试(见图2) 。以组分峰面积为纵坐标,质量浓度
为横坐标,绘制标准曲线。
图2　标准溶液的色谱图
1. 4　样品处理
1. 4. 1　固体样品　准确称取2. 0～5. 0 g固体样品于50 mL
的比色管,超声波提取30 min,放置冷却后,用甲醇稀释至刻
度,摇匀。静置30 min后取上清液10 mL 氮吹至近干,用
20%甲醇水定容至10 mL,经0. 45μm的滤膜过滤,待测。
1. 4. 2　液体样品　准确吸取5～10 mL液体样品置于50 mL
比色管中,加入20%甲醇水40 mL,加入5%三氯乙酸5 mL,
用20%甲醇水稀释至刻度,摇匀, 4 000～8 000 r/min离心
5 min,取上清液,经0. 45μm的滤膜过滤,待测(见图3) 。
2　结果与讨论
2. 1　检测波长的选择与定性
取浓度为50μg/mL的三聚氰胺标准使用液及某待检样
品,在200 ～400 nm波长处扫描, 发现三聚氰胺在200 ～
220 nm处有强烈的吸收,在234. 1 nm处有吸收峰(见图4) ,
在235. 0处的吸收峰峰型对称,存在的干扰少,且流动相在
低于210 nm的波长下背景吸收较高,故选用235. 0 nm为检
测波长。样品中成分复杂,可采用二极管阵列检测器对其进
行光谱扫描,并以保留时间和三维光谱图相似性系数进行定
性。
图3　样品的色谱图
图4　标准溶液的3D图
2. 2　流动相的优化
对不同流动相以及不同比例进行了多次试验。结果发
现用乙腈为流动相时,乙腈正好在三聚氰胺出峰处有背景吸
收,很难分离,且乙腈毒性大。采用硫酸铵( 0. 02 mol/L ) ∶
甲醇= 94 ∶6 (V /V) , 三聚氰胺与流动相甲醇的背景吸收完
全分开,且峰型对称,出峰时间比较理想。
2. 3　沉淀剂的选择
因为三聚氰胺有三个胺基,易与金属离子络合,采用
106 g/L亚铁氰化钾2 mL和219 g/L醋酸锌沉淀蛋白质2 mL
时,三聚氰胺会有损失,回收率仅为55%。三聚氰胺是酰胺
类物质,是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。采用5%三氯乙
酸沉淀蛋白质5 mL,效果非常理想,但时间不宜过长,避免三
聚氰胺包合于沉淀中,降低提取率。
2. 4　线性范围与检出限
在试验条件下,用峰面积比对浓度绘制曲线,三聚氰胺
在0. 1～150μg/mL之间均具有良好的线性关系, 以基线噪
声三倍峰面积对应的三聚氰胺最低检测限为0. 01 μg/mL,
回归方程式为:
y = 2. 99 ×104x - 4. 00 ×103
相关系数R = 0. 999 9。
2. 5　精密度试验
取三聚氰胺样品加标溶液做精密度试验,按上述色谱条
件及试验方法分别对50μg/mL和100μg/mL两个不同浓度
的样品加标溶液进行测定,重复进样10次, RSD小于1. 2% ,
说明该方法具有较高的精密度。
2. 6　回收率试验
采用加标测定回收率。取3种样品各3份,分别加入一
定量的混合标准使用液。测定结果(见表1,已去本底值) 表
明:平均回收率基本在98. 8%～101. 5%之间,完全可以满足
日常分析的要求。
3　结论
此方法样品处理简便易行、快速。同时利用二极管阵列
检测器定性,成本低于质谱,所测结果准确度高,易于推广,
适于测定高蛋白食品中的三聚氰胺。
参考文献
1　王箴. 化工辞典(第四版) [M ]. 北京:化学工业出版社, 2003, 3.
2　张亚飞,乐国伟,施用晖,等. 小麦蛋白Alcalase水解物免疫活性
肽的研究[ J ]. 食品与机械, 2006, 22 (3) : 44～46.
3　GC2MS Scerrn for the Presence ofMelamine and Cyanuric Acid [ S].
FDA /ORA Forensic Chemistry Center SOP T015, 2007.
4　Update FCC DevelopmentalMelamine Quantitation (HPLC2UV) [ S ].
FDA /ORA Forensic Chemistry Center SOP, 2007.
5　吴明礼,陈彩虹. 高效液相色谱法(HPLC)测定单氰胺中中三聚
氰胺的含量[ J ]. 宁夏石油化工, 2005 (2) : 24～26.
6　施奈德L R,格莱吉克J L,柯克兰J J. 实用高效液相色谱法的建
立(第一版) [M ]. 北京:科学出版社, 2000, 5.

yxy0725

不实用，这些设备有几个饲料厂有？普通的检验中心都未必有

银狐

上传一些可定性的检测方法，经济适用

今宵酒醒何处

就是啊，普通的饲料企业根本不可能配有这些设备的，要控制原料质量真有点纸上谈兵的感觉。

jcq2008

还有没有更实用的办法啊。比如说，闻一下就知道了，:tiaotiao:

行者说饲

这就是中小企业的软肋！

蛋白饲料原料的市场形势是这样的，

生产蛋白饲料的企业规模越大知名度越高产品越是供不应求，

大型饲料企业本身有足够的资金实力购置高档的检测设备，

同时对于原料采购有足够的话语权，

这些优质的原料都自然而然的流入大企业，

所以大企业即便是没有检测设备，

只要他选择和这些名牌蛋白饲料企业合作就没有问题，

因为这些名牌企业的蛋白饲料产品供不应求，

所以他没有必要掺假可以保真。

而哪些中小企业最后的采购渠道就被压缩，

被迫和一些经销商或小规模的蛋白饲料生产企业合作，

无疑增加了自己的风险。

因为检测设备的高昂价格，

小企业又不能去买，

因此就存在风险。

molyzsl

听说现在有一种快速检测的方法，不知哪位可以提供？

王立水

最好有根简便地方法。

ykou001

世卫制定三聚氰胺摄入限额 每公斤体重0.2毫克
文章来源：东方早报     发表时间：2008-12-08 08:10:17
关键字：  三聚氰胺
　　世界卫生组织日前制定了三聚氰胺每日摄取量最高标准，认为每公斤体重每日0.2毫克应无危险。这就是说，一个体重50公斤的成年人每天如果摄取10毫克以下三聚氰胺，应该不会有健康危险。

　　综合新华社电等 世界卫生组织(WHO)5日说，由于食品在生产、加工、包装及运输等环节有时会被三聚氰胺污染，食品中含有微量三聚氰胺是不可避免的，因此该组织将这一化学物质每日可容忍摄入量设定为每公斤体重0.2毫克（0.2mg/kg）。

　　微量三聚氰胺“不可避免”

　　据世界卫生组织官方网站报道，该组织日前在加拿大渥太华就三聚氰胺问题举办了一个由食品安全专家参加的会议，与会的21位专家没有确定三聚氰胺的“安全”摄入量，只是设定了一个“可容忍”摄入量，如果按照这一标准计算，一个体重为50公斤的成年人每天的三聚氰胺可容忍摄入量不应超过10毫克。

　　不过专家们同时强调，三聚氰胺是工业用化学品，根本不应该出现在食品之内。他们还表示，从医学角度而言，无法为食品制定三聚氰胺安全含量标准。

　　三聚氰胺无味低毒，常用于制造日用器皿、装饰材料以及织物整理剂等。如果三聚氰胺加入兑水牛奶后可以提高其蛋白质读数以及浓稠度，掩盖牛奶兑水的事实。

　　防止人为添加

　　世界卫生组织粮食安全负责人约尔根·施伦德表示，希望这一标准能更好地指导各国卫生部门采取有效措施，防止人为在食品中添加三聚氰胺的事件发生，以确保公众健康。

　　被大量添加三聚氰胺的三鹿奶粉事件曝光后，三聚氰胺添加物丑闻席卷了中国整个乳品行业。根据中国卫生部12月1日最新通报指出，截至11月27日8时，全国累计报告因食用三鹿牌奶粉和其他个别问题奶粉导致泌尿系统出现异常的患儿29万余人。

　　10月初，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局发布公告，公布了乳制品及含乳食品中三聚氰胺临时管理限量值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg；液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg；含乳15％以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg。