常规实验项目操作规程
一、细菌的分离培养和鉴定
(一)细菌的分离接种
1、平板划线分离法:
以灭菌接种环取待检材料少许,左手打开平皿盖,使盖与底成30度角,将材料先涂于培养基平板上的一边,作为第一段的划线,然后将接种环置于火焰上灭菌,再以该接种环的第一段划线处相交接依次划线数次为第二段划线,再如上法灭菌,接种划线,依次划至最后一段,灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌逐渐减少,即能获得单个菌落,划线时接种环应与培养基面平行,并应尽量将接种环放平,可以减少划破培养基的现象。划线间的距离宽窄要适宜,一般以相距0.5厘米左右为宜。最后一段划线不要与第一段划线相交。接种材料后肉汤培养基中含菌数量不太多时,可用灭菌接种环取待检材料,在平板表面的一角涂布后,由左右两边向下移动连续平行线,直至划满整个平板表面。接种材料后,盖好平皿盖倒置于37℃温箱中培养。
2、斜面分离法;
每份待检材料用三支斜面培养基,以灭菌接种环沾取少许病料,放在第一管斜面培养基底部的凝结水中,共移三接种环,轻轻混合,依次由第一管向第三管移三接种环混合液,将斜面稍平放,使凝结水由底部向斜面流动,左右倾斜,让凝结水布满斜面表面,然后将培养基直立,置于37℃培养,由于病料的递次稀释,第二、三斜面上常可出现单个菌落。
3、平板倾注法:
取数管已溶化的深层琼脂或含有特殊物质的琼脂,用记号笔标记顺序后,置于50℃恒温水箱中,以灭菌接种环或毛细吸管取材料少许加入第一管中,将试管放于两手掌中搓转片刻使材料在培养基中混合均匀,从第一管中取材料1-3接种环,加入第二管中,混匀后,取材料加入第三管中,如此将全部培养基接种完毕。取相同数量的灭菌平皿,标记后,将各管中的材料分别倾于相应的平皿中,并使之均匀分布,待凝固后,将平皿倒置于温箱中培养,此法不仅用于分离培养,而且可用作材料中活菌的记数。
(二)细菌的纯培养
待检材料中的细菌经上述方法分离培养后,取出加以检查。先用肉眼观察长出的菌落是纯一的,还是混杂的。多数情况下,沿涂布划线处长出较多的一种菌落,是材料中的病原菌的可能性较大,少数零散的菌落多为在操作过程中由外界进入的杂菌。为慎重,可挑取一部分菌落,制成革兰氏染色片,置于镜下检查,如片中的细菌的形态和染色性统一,则用灭菌接种环仔细挑取该菌落的剩余部分,接种在适当培养基上,置温箱中培养,待菌落长出后,再经肉眼及染色片的镜检证明统一后,即成为该菌的纯培养。
(三)细菌的生化鉴定
细菌在培养基中生长时,由于它的分解代谢和合成代谢作用,可使培养基中的某些物质转化为其它物质,由于细菌的种类不同,它们的代谢产物也不同。细菌的代谢活动是受细菌本身所具有的酶控制的,细菌的种类不同,它们所具有酶也不同。这些代谢产物和酶,可以利用化学方法检查出来,这种方法可以叫生化实验,生化实验在鉴定细菌种类上有十分重要的作用。
1、大肠杆菌生化特性:葡萄糖○乳糖○甘露醇○阿拉伯糖+吲哚+甲基红+VP-尿素酶-明胶液化-硫化氢-动力+/-柠檬酸盐利用-
2、沙门氏菌生化特性:葡萄糖产气+乳糖-蔗糖-水杨素-侧金盏花醇-靛基质-甲基红+VP-硫化氢+/尿素-明胶-丙二酸钠-氢化钾-动力+赖氨酸脱羧酶+苯丙氨酸脱氨酶-柠檬酸盐+
3、巴氏杆菌生化特性;葡萄糖+果糖+半乳糖+蔗糖+肌醇-菊糖-麦芽糖-水杨素-鼠李糖-吲哚+尿素醇-氧化酶+接触酶+筋胶液化-硝酸盐还原+动力-溶血-麦康上生长-
二、药敏试纸片的制备
(一)配制试剂:
1、PH6.0 磷酸盐缓冲液
磷酸氢二钾 0.2克 磷酸二氢钾 0.8克 蒸馏水 加至100毫升
15磅高压20分钟备用
2、PH3.0 枸橼酸缓冲液
枸橼酸 0.7克 磷酸氢二钠 0.3克 蒸馏水 加至100毫升
15磅高压20分钟备用
3、PH7.8~8.0 磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾 0.0523克 磷酸氢二钾1.672克 蒸馏水 加至100毫升
15磅高压20分钟备用
4、1N盐酸
盐酸 0.9毫升 蒸馏水 加至10毫升摇匀
5、蒸馏水若干灭菌备用。
(二)药敏片的制备:
1、药物与溶剂使用量
药名
| 药量(mg)
| 溶液
| 溶液量(ml)
| 代
号
| 药名
| 药量(mg)
| 溶
液
| 溶液量(ml)
| 代
号
| 青霉素
| 10
| PH6.0
| 4
| 1
| 痢菌净
| 10
| 水
| 10
| 18
| 新霉素
| 20
| PH6.0
| 10
| 2
| 诺美杀星
| 20
| 水
| 5
| 15
| 氨苄青霉素
| 10
| PH6.0
| 2.5
| 3
| 百病消
| 0.2
| 水
| 50
| 16
| 庆大霉素
| 0.5
| PH6.0
| 5
| 4
| 先锋6
| 20
| 水
| 15.5
| 21
| 土霉素
| 20
| PH3.0
| 5
| 5
| 阿莫西林
| 30
| 水
| 25
| 22
| 链霉素
| 40
| PH7.8
| 13.1
| 6
| 力克霉素
| 40
| 水
| 5
| 23
| 红霉素
| 10
| 水
| 4
| 7
| 环丙杀星
| 20
| 水
| 10
| 24
| 氯霉素
| 40
| 水
| 10
| 8
| 强力霉素
| 30
| 水
| 15
| 30
| 痢特灵
| 40
| 水
| 10
| 9
| 喹乙醇
| 20
| 水
| 10
| 11
| 氟派酸
| 20
| 水
| 10
| 10
| 恩诺杀星
| 20
| 水
| 50
| 12
|
2、制备过程:
(1)新华滤纸打出直径6mm的纸片,打上代号,装入青霉素小瓶内,每瓶100片15磅高压灭菌20分钟,取出后烘干备用。
(2)按要求配制药液,然后取药液1ml加入有纸片的小瓶内,使纸片完全浸透药液,4℃冰箱放置1~2小时,取出用无菌镊子将纸片一张张平铺在无菌平皿内,置37℃温箱,将平皿盖开一小缝,以便放出蒸汽,约2~3小时,待干燥后装入无菌青霉素小瓶内,加塞,放入有干燥剂的容器内,冷暗处保存备用。
3、说明:
(1) 金霉素、土霉素、四环素等通常用PH3.0枸橼酸缓冲液稀释。
(2) 青霉素、庆大霉素、卡挪霉素等用PH6.0磷酸缓冲注液稀释。
(3) 对PH要求不严格的药物,如磺胺类药物可用蒸馏水稀释。
(4) 有些不溶于水的药物,可选择可溶解它的溶剂先溶解后再稀释,如四环素用HCL溶解,氯霉素、红霉素等用95%乙醇溶解。
三、染液的配制
(一)改良的革兰氏染色法
1、染液的配制
(1)结晶紫染液 结晶紫1克,蒸馏水100毫升。
(2)革兰氏碘液 碘片10克,碘化钾20克,蒸馏水1000毫升。
(3)脱色剂 95%乙醇2份,丙酮(化学纯)1份。
(5) 复染剂 沙黄1克,蒸馏水100毫升。
2、染色法
(1)抹片,空气干燥,缓慢通过火焰2-3次固定。
(2)用结晶紫染液染色约1分钟。
(3)直接加革兰氏碘液于抹片上(不同法去结晶紫)助染约1分钟。
(4)水洗后,加脱色剂,反复冲洗。
(5)水洗后,用沙黄液复染约30秒钟。
(6)水洗后,用滤纸吸干、镜检。
(二)瑞氏染色法
1、染液配制:瑞氏染色剂粉0.1克,纯粹白甘油1.0毫升,中性甲醇60.0毫升。
置染料于一个干净的乳钵中,加甘油后研磨至完全细末,再加入甲醇使其溶解,溶解后盛于棕色瓶中经一星期,过滤于中性的棕色瓶中,保存于暗处,该染色剂保存时间越久,染色的色泽愈鲜。
2、染色法
(1) 涂片任其自然干燥。
(2)加染色液约1毫升于涂片上,染色1分钟,使标本被染液中的甲醇所固定。
(3)再加上与染液等量的磷酸盐缓冲液(或自来水)用口吹气,使染液与蒸馏水充分混合,并防止染液的沉淀,经5分钟左右,使表面显金属的闪光。
(4)蒸馏水冲洗后,用滤纸吸干、镜检。
四、玻璃器皿的准备
(一)处理
1、新购入玻璃器皿的准备:新购玻璃器皿常附着有游离的碱质,不可直接使用,用前必须先用洗衣粉水或清水洗净,然后在1%~2%盐酸溶液中浸泡24小时,以中和其碱质,最后用清水洗净盐酸,干燥后备用。
2、用后玻璃器皿的处理:凡被病原微生物污染过的玻璃器皿,在洗涤前必须先进行严格消毒。
(1)一般玻璃器皿(如平皿、试管、烧杯、三角瓶等)均可放在高压消毒器内在15磅压力下灭菌20~30分钟。
(2)吸管、玻片、盖玻片等可浸泡于5%石炭酸或其他的消毒剂溶液中48小时。浸泡吸管的玻璃筒底部应铺以纱布棉垫,以防投入吸管时管尖破裂。吸过血清、血液的吸管,若无病菌污染,可立即用清水冲洗。
(3)盛有固体培养基(如琼脂)或油脂(如液体石蜡、凡士林)的玻璃器皿,应于消毒后趁热将其中的培养基或油脂倒净,并单独用温水洗净,以免污染其他玻璃器皿。
(4)凡盛有血液或血清的试管或玻璃瓶等,在高压灭菌之前,必须将其中血清或血液倒入一烧杯中(无病菌污染的血清和血液可直接用清水洗净),然后洗净再进行灭菌。
(5)凡曾吸取琼脂的吸管,不论是否需要消毒,均应于用后立即用热水冲洗干净,然后再进行消毒,否则琼脂凝固,不易冲洗。
(二)洗涤
1、一般玻璃器皿的洗涤
(1)将消毒处理过的玻璃器皿浸泡于清水中,用毛刷或试管刷沾洗衣粉,若器皿上有油污或记号笔标记,用热水刷洗。最后用清水冲洗2~3次。
(2)经清水冲洗后,如仍有污迹,可用清洁液浸泡24小时,取出用清水冲洗干净。如不能立刻刷洗,也应用清水浸泡,以免干燥后不易洗刷。
2、吸管的洗涤
(1)将吸管从消毒剂中取出后,先用细铁丝取出管口的棉塞,若棉塞太紧不易取出时,可将铁丝尖端压扁,插入棉塞与管壁之间,轻轻一转即可将棉塞拉出。
(2)将吸管浸泡于洗衣粉水中,以特制的毛刷或尖端缠有少许棉花的细铁丝洗刷吸管内部,铁丝尖端的棉花应随时更换。
(3)以胶皮管一根,一端接冲洗球,另一端接吸管的尖端,在清水中反复冲洗数次。若仍有污迹,再按(2)处理或置于清洁液缸内浸泡24小时,取出后充分水洗。
(4)洗净的吸管最后再用蒸馏水冲洗一遍,倒立于底部垫有棉花的铁丝筐中晾干。
3、玻片的洗涤 取出经过消毒的玻片放入洗衣粉水中煮沸10分钟,然后用纱布沾洗衣粉擦洗,再经清水冲洗,放入清洁液中过夜,取出后用水洗去清洁液。
4、云雾状玻璃器皿的洗涤:凡玻璃器皿上有云雾状而不能用普通方法洗净时,可用清洁液浸泡24小时,再以清水洗去清洁液。然后用洗衣粉水洗刷干净为止。
(三)干燥
洗净的玻璃器皿倒置于清洁的木架上或铺有清洁纱布的平台上,令其自然干燥。若急需使用,可将玻璃器皿放入50℃左右干燥箱中迅速烘干,但温度不宜太高,以免玻皿破裂。玻皿干燥后,用干净的绸布拭去干后的水迹,玻片干燥后,保存在清洁容器内,或浸于95%酒精中,使用时再用软布擦去。
(四)包装
如玻璃器皿需要灭菌,应于灭菌前将玻璃器皿妥善包装,以免灭菌后被环境中的杂菌污染。
1、平皿的包装:将平皿用纸严密包好,一副或数副包成一包,或放入金属盒(筒)内直接进行灭菌。
2、吸管的包装:吸管包装前,应先用细铁丝塞少许棉花于吸管口端距管口约半寸处,将吸管一一分别用纸包好,然后大纸将数只吸管包成一束,也可将包好的吸管置于金属筒中进行灭菌。
3、试管和其他玻璃器皿的包装:试管和其他玻璃器皿的开口处必须包装严密,加棉塞或直接用纸包扎。棉塞要松紧适度,既要易于拨出,又不能自行脱落为佳。
(五)灭菌
用于盛放无菌材料和细菌分离培养用的清洁玻璃器皿,使用前必须进行灭菌。可用干热灭菌或高压蒸气灭菌。
1、干热灭菌:用干热灭菌箱,通常在160℃温度下处理2小时,温度超过180℃时,棉塞和纸包易烧焦起火。器皿放入烘箱之前必须干燥,以免引起玻璃破碎,器皿在烘箱内不宜过满,应留有一定空隙,灭菌后应待温度降至60℃以下时,才能开门取器皿,否则玻璃可能因突燃遇冷而破碎。
2、高压蒸气灭菌:用高压灭菌器,用15磅压力处理20~30分钟,压力器指针上升至2~3磅时徐徐打开气门,排出灭菌器内所存留的空气,直至排出的蒸气内不夹杂空气为止,然后关紧气门,压力上升至15磅时开始计时。高压蒸气灭菌后,玻璃器皿上常常有水珠,可再用烘箱(60~80℃)烘干。
五、无菌操作技术注意事项
1、为了避免外界环境中细菌的污染。在检测过程中如倾注培养基平板、接种、移种、分离纯菌、活菌记数、制备菌悬液等都要在无菌室内进行,如果没有无菌室,要在酒精灯周围10厘米的无菌区内操作。
2、实验室内必须保持整洁,除必要的设备和仪器外,其它物品都不应放在室内。每天清晨或试验工作结束后,均应打扫卫生,工作台面,边台和桌椅等均用消毒溶液擦拭。
3、实验人员在进入无菌实验室前,必须穿戴整洁的工作衣帽和口罩,换鞋后才允许入内。
4、在检测工作中必须做到严格无菌操作防止污染和感染,使用的器械、容器和培养基等,必须要经过灭菌。
5、在检测工作中,不慎菌液滴在桌面或地面,或溅在其他物体上,必须立刻加以处理,污染的玻璃器皿和器械,可进行高压灭菌或在消毒液中进行消毒。 |