应用 RT- PCR 检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染

peteryuanfeng

应用 RT- PCR 检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染
罗玉均 1，张桂红 1，陈建红 2，张济培 2，潘全会 1，钟植文 1，何逸民 1，孔留五 1
（1.华南农业大学兽医学院，广东    广州    510642；2.佛山科学技术学院生命科学学院，广东    佛山    528231）
中图分类号:   S858.32 文献标识码:   A 文章编号:   1005-8567(2007)03-0020-02
收稿日期: 2007- 03- 15
鸭肝炎病毒Ⅰ型(duck  hepatitis  virus  Ⅰ，
DHVⅠ)感染是雏鸭的一种急性高度致死性传染病，
主要侵害 4  周龄以内的雏鸭，特别是 1 周龄以下
的雏鸭最易感染，死亡率较高，是危害养鸭业最为
严重的传染病之一[1]。1945 年在美国首次发现，我
国于 1963 年在上海首次报道了该病的临床病例，
至今，全国各养鸭地区均有不同程度的发生和流
行。目前，已有多种检测 DHVⅠ抗原的方法，如免疫
电镜、Dot-ELISA 和病毒中和试验等，这些方法在
DHVⅠ的诊断中各有优势。PCR  作为一种新的分子
生物学检测技术，具有灵敏度高、快速、特异、操作
简单等优点[2～4]。本实验通过目前已发表的 DHVⅠ基
因组序列相对保守的区域设计引物，成功建立了
RT-PCR 方法检测鸭肝炎病毒 1 型。
1    试验材料
1.1    病料    无菌采集广东省 2 个地区（南海、三
水）送检的病死鸭肝脏病料各 1 份，置于 -20℃保
存备用。
1.2    参考毒株    鸭肝炎病毒 I 型，新城疫病毒
（NDV  clone-30）和禽流感灭活病毒(AIV)（H
5
和
H
9
亚型）。
1.3    主要试剂    Trizol  试剂、EX-Taq  DNA  聚合
酶、2.5  mmol/L  dNTP、AMV  反转录酶、RNA 酶抑制
剂（Rnasin）、10.0  mmol/L  dNTP、Marker2000  均
购自 TaKaRa 公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.4    引 物    参照 GenBank 中发表的 DHVⅠ全基
因序列，应用生物学软件 Primer5.0 设计扩增
DHVⅠ3D 基因序列的特异性引物，引物序列为 F:
5-ATgTACCACTgTggTCATT-3，R:5-TCTTCAgAATTCA
TCTC-3，扩增片段长度为 250  bp，由上海 Sangon
生物公司合成。
2    方法
2.1     病 料 样 品 的 处 理      取 无 菌 采 集 的 病 料
0.2～2.0  g 于玻璃研磨器中，研磨并用 TEN  缓冲
液稀释成 1:3 乳剂，置于 EP 管中，-20℃/ 室温反
复冻融 3 次，每次融化时使其在室温中缓慢融化，
以便细胞破裂使病毒释放出来。融化后的溶液以
4  000  r/min 离心 10  min，取上清经除菌滤器过
滤。滤液 -20℃保存备用。
2.2    核 酸 的 抽 提     按 TRIZOL  Reagent  说明书
提取 AIV(H
5
和 H
9
)、NDV  、DHVⅠ总 RNA。
2.3    cDNA 的 合 成    取抽提的 RNA 样品进行反
转录。采用 20μL 反转录体系，其中含 1μL(25
nmol/L)  下 游 引 物 、2μL  10.00  mmol/L  dNTP、
4μL  5×RT-PCR 缓冲液、1μL  (40  U/L)AMV 酶、
8μL  RNA 模板、1μL  RNase 抑制剂，最后用 DEPC
水补至 20μL。42℃水浴 1  h，合成 cDNA，置 -20℃
保存备用。
2.4    RT- PCR 扩增    以 DHV  I  cDNA 为模板进行
PCR 扩增。反应体系为 25μL，其中 EX-Taq 酶预混
剂，25  nmol/L 的上、下游引物各 0.5μL，模板
2μL，加灭菌水补足体积至 25μL。旋涡震荡，混匀
后置于 PCR 仪中扩增。扩增程序为：94℃  3  min，1
个循环；94℃  1  min、49℃  1  min、72℃  1  min，30
个循环；72℃延伸 5  min。产物通过电泳进行检测。
2.5    特异性试验    以 DHVⅠ、AIV  (H
5
和 H
9
)、NDV
进行特异性检验。
2.6    敏感性试验    将 DHVⅠ的 cDNA 用紫外分光光
度测其含量为 0.6μg  /μL，然后进行 10 倍系列
稀释，然后进行 RT-PCR 扩增，以检测其敏感性。
2.7    临床样品的检测    按上述方法对临床病例
的组织样品进行 RT-PCR 检测。
3    结果与分析
3.1    特异性检验结果    见图 1。以 DHVⅠ扩增出
与试验设计相符的 250  bp 电泳条带，而对照的
AIV(H
5
和 H
9
)、NDV 扩增结果为阴性。
3.2    敏感性扩增结果    见图 2，该 RT-PCR  可以
检测到 0.06  ng/μL  DHVⅠ的核酸模板。图 1    RT- PCR 特异性扩增结果
M: Mar ker  DL2000; 1. DHVⅠ; 2. AI V; 3. NDV
图 2 RT- PCR 敏感性扩增结果
M: Mar ker  DL2000; 1: 0. 6  μg/ μL; 2: 0. 06  μg/ μL;
3: 6  ng/ μL; 4: 0. 6  ng/ μL; 5: 0. 06  ng/ μL; 6: 1  pg/ μL
3.3    临床病料检测结果    见图 3。
图 3    临床病料检测结果
M: Mar ker  DL2000; 1: 阴性对照;
2: 南海 DHVⅠ病料; 3: 三水 DHVⅠ病料。
4    讨论
成年鸭在自然条件下被 DHVⅠ感染后，可长期
带毒和排毒而不出现临床症状，但进入环境中的
DHVⅠ对 4 周龄内的雏鸭却有高致病性，从而导致
该病毒在鸭群中广泛传播[1]。因此，建立快速、敏感、
特异的诊断方法是有效预防和控制该病的关键措
施之一。目前，对 DHVⅠ的诊断主要依靠流行病学
资料、临床症状、病理变化及病毒的分离和鉴定。虽
然目前实验室 DHVⅠ检测方法有病毒的分离、
ELISA 与中和试验(VN)等，但这些方法用于检测感
染 DHVⅠ的死亡鸭组织中的病原时存在不足，如检
测所需时间长、敏感性较低等，临床应用受到一定
的限制。本实验通过建立 RT-PCR 方法，快速检测感
染 DHVⅠ的死亡鸭组织，而且检测结果表明该方法
具有较高的特异性与敏感性。RT-PCR 为 DHVI 的临
床诊断及流行病学调查提供了可行的方法。
参考文献:
[1] SAIF YM,BARNES HJ,GLISSON JR,et al.Diseases of Poul-
try[M].11thed.Ames:Iowa State University Press,2003.
343-354.
[2]  HANSEN  WR,BROWN  SE,NASHOLD  SE,et  al.Identification
of duck plague virus by polymerase chain reaction[J].
A  vian  Dis,1999,43:106-115.
[3]  PRITCHARD  LI,MORRISSY  C,PHUC  KV,et  al.Development
of  a  polymerase  chain  reaction  to  detect  Vietnamese
isolates  of  duck  virus  enteritis  [J].Vet  Microbiol,
1999,68:  149-156.
[4]  LUND  M,NORDENTOFT  S,PEDERSEN  K,et  al.Detection  of
Campylobacterspp.in  chicken  fecal  samples  by  real-
time  PCR[J].J  Clin  Microbiol  ,2004,42(11):5125-532.
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兽医临床
应用 RT- PCR检测鸭肝炎病毒 I  型感染—罗玉均,   等
21  ·    ·

jack

这份研究做得好，但在实际应用的意义应考虑。

jack

后续的工作应该如何预防和快速诊断和治疗。

jack

朋友，有好资料给我们分享。

zhangyy4206

常规实验室检测方法，是拿来骗分的吧

haiwuya

对于基层的兽医工作者，这样的文章基本上起不到什么作用。这是实验室研究人员用的资料，但是这样资料的关键地方，有可能做了隐藏，所以研究人员也请酌情使用。