细胞ELISA实验手册

bluewing2003

一、福尔马林固定细胞
1、用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞；
2、收集细胞并计数；
3、离心，1500rpm，10min；
4、用完全培养基重悬细胞于适当的浓度，
上皮细胞4×105个细胞/ml，
纤维细胞2×105个细胞/ml；
5、滴加到96孔培养板中，100ul/孔；
6、37C环境孵育过夜；
7、用PBS洗板两次；
8、每孔加125ul 10％福尔马林缓冲液；
9、于室温环境下固定15min；
10、用双蒸水洗涤三次；
11、晾干；

12、贮存于2-8 C.

二、试剂：
1、PBS：1％ BSA
2、PBS：2％BSA
3、碳酸盐缓冲液：
1.59g Na2CO3
2.93g NaHCO3
溶解于900ml双蒸水中，检测并调整pH至9.6，定容至1L；
4、10×底物液，pH6.0
36.6g一水合柠檬酸
113.5g
磷酸氢二钾
溶解于900mL双蒸水中，调pH至6.0，定容至1L；
5、0.3％H2O2：用双蒸水按1：100稀释30％的双氧水
6、OPD贮存液，4.0％：4g OPD溶解于100ml双蒸水，分装后保存到-20 C,注意避光。
7、4.5N H2SO4
12.0mL浓硫酸
88.0ml双蒸水混合

三、实验步骤：
1、用双蒸水洗涤ELISA板两次；
2、每孔加250ul含2％BSA的PBS；
3、37C孵育1h；
4、双蒸水洗板三次；
5、每孔加50ul腹水，上清，或用含1％BSA的PBS稀释后的稀释品；
6、37C孵育2h；
7、双蒸水洗板五次；
8、每孔加50ul用含1％BSA的PBS稀释的HRP酶标抗鼠IgG；
9、37C孵育1h；
10、用双蒸水洗板5次。用碳酸盐缓冲液洗两次；
11、加工作浓度底物液50ul/孔，配方如下：

0.5ml 4.0％ OPD

5ul
30％H2O2

1.0 ml 10× 底物缓冲液

8.5ml 双蒸水
12、在室温下孵育20min；
13、加4.5N 硫酸溶液 25ul/孔；
14、在酶标仪上测OD490波长的值。

注意：
1、检测上清按1：5稀释；
2、检测腹水可按1：100稀释