（福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002）
关键词：大肠杆菌； Kirby－Bauer法；耐药性；流行病学
Study on the epidemiology of E.coli resistance in pig farms YU Dao-jin, HUANG Yi-fan, DENG Wen-hua, FANG Xue-yan (Collge of animal science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)
by using the Kirby-Bauer method recommended by NCCLS. The result indicated that there is little differences between the two pig farms， though there are many differences in the using of antibiotic. It is prompted that there are some disciplinarians in the form of antibiotic resistance. To some antibiotic, once resistance has been formed, it is difficult for them to resume. There is directly relationship between the using frequency and the appearance of multi-resistant bacterium.
Key words: E.coli；Kirby-Bauer method；antibiotic resistance；epidemiology
细菌对养殖场常用抗生素产生耐药性已经引起普遍的关注，其中大肠杆菌的耐药性研究较为集中也较为深入。目前研究多集中在对耐药性进行一定范围的调查和运用分子生物学手段进行耐药机理的研究，而对细菌耐药性的流行病学研究较少[1-3]。本研究对用药习惯和用药频率存在较大差异的新旧两个猪场分离到的大肠杆菌进行了17种抗菌药物的敏感性测试，以期寻求细菌耐药性形成的一些规律，为减少耐药细菌的出现和指导临床合理用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
菌株
2004年4月，在福建省福清市两个有代表性的规模化养猪场，分离到大肠杆菌共计142株。
1.1.2
培养基
麦康凯琼脂、水解酪蛋白琼脂、营养肉汤等购自上海伊华医学科技有限公司。
1.1.3
药敏纸片
按照FDA认可的临床微生物实验室非娇嫩细菌常规药敏试验和报告规定选
择抗生素。1 7种抗生素药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.4细菌生化鉴定管
肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管（11×20支/盒）购自杭州天和微生物试
剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1选择试验猪场
选取新旧两个有代表性的规模化养猪场，旧场建于1997年5月，由于建场历史较久，曾经出现过较大的疫情，目前场内正在遭受断奶仔猪多系统衰竭综合征的影响，因此很经常进行预防性用药。对仔猪拉稀的治疗原来有使用过氯霉素，现在主要以庆大霉素、恩诺沙星等药为主，同时四环素类抗生素、磺胺类抗生素、阿莫西林、先锋Ⅳ等药现在经常用于饲料添加。新场建于2003年年底，由于猪场建筑设计比较合理，饲养管理水平较高，猪场到目前为止未有大的疫情出现，预防性用药很少，对仔猪拉稀的治疗主要以恩诺沙星等药为主。
1.2.2样本采集
以灭菌棉签采集仔猪新鲜拉稀粪便共36个样本，将采集的标本置于灭菌的营养肉汤培养管中保存，其中新场17个样本，旧场19个样本。
1.2.3细菌的分离与纯化
把营养肉汤培养管中的粪便标本，用无菌接种棒挑取菌液接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养24小时，观察菌落的生长情况。在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色菌落后，挑取典型的单个菌落，接种于伊红美蓝琼脂培养基上，37℃培养24小时，观察形成紫黑色有或没有金属光泽的菌落；镜检为革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌，单在或成对。
1.2.4细菌鉴定及保存
采用肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管进行细菌的鉴定。将分离纯化的可疑大肠杆菌菌株接种于系列细菌生化编码微量鉴定管内，37℃培养24小时后，对细菌生化反应结果进行判断并编码，按编码值检索肠杆菌科细菌生化编码表即可获得结果，对不确定菌株进一步补充生化反应予以判定。
经生化反应鉴定为大肠杆菌者，在新鲜菌液中加入灭菌甘油制成10%（v/v）甘油菌，置于-20℃冰箱保存备用。
1.2.5细菌药敏试验：
严格按照美国临床实验室标准委员会（National
Committee
for
Clinical
Laboratory
Standards， NCCLS）推荐的K-B法进行[4]。首先在营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于2ml普通肉汤管内， 37℃培养16-18小时后，用MH肉汤调制菌悬液，使其达到0.5麦氏比浊管浊度。用灭菌棉拭子醮取调制好的菌悬液，均匀涂抹在MH琼脂平板上，涂好后放置3-5分钟，待培养基表面水分吸干后，即用无菌眼科镊将药敏纸片贴于平板上，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。37℃培养16-18小时后观察结果。
1.2.6细菌药敏试验结果判定标准
参照NCCLS（1999）公布的标准以敏感（S）、中介（I）、耐药（R）3种形式对抑菌圈大小作出解释，判定标准如表1所示。
2 结果与分析
2.1 不同猪场大肠杆菌耐药情况及比较
新旧两猪场分离的大肠杆菌对抗生素的耐药情况分别如表2和表3所示。本次试验结果表明，在各类抗菌药中，从两个猪场分离到的大肠杆菌对四环素、复方新诺明等常用抗生素的耐药率较高，对已经不再使用的氯霉素也仍然有高的耐药率，对氨基糖苷类的庆大霉素耐药率较高，而同类的链霉素和丁胺卡那则较敏感。值得引起注意的是氟喹诺酮类抗生素在本次试验中表现出比较高的耐药率，而细菌对临床少用的抗生素如多粘菌素、氨曲南、头孢哌酮等药物的敏感性较高。
对两个场大肠杆菌的耐药谱进行比较，结果如图1所示。虽然两个场建场时间不同，药物使用习惯和使用频率存在较大差异，但两场的细菌耐药谱却比较一致，许多情况下仅为耐药程度的差别。总体来说，旧场分离的细菌对各种抗生素表现出较高的耐药率，一些在新场非常敏感的抗生素，在旧场已经表现出一定程度的耐药。比较其他学者的研究成果[5-6]发现，大肠杆菌在不同的环境下对氨苄青霉素、阿莫西林、氯霉素、复方新诺明和四环素类药物都比较容易产生较高水平的耐药，而且这种耐药性一般来说比较持久。
2.2 不同猪场大肠杆菌多重耐药情况及比较
考察两个猪场大肠杆菌多重耐药情况，结果如图2所示。总体而言，两个场的细菌多重耐药情况比较接近，新场分离细菌6重耐药以下的细菌数明显多于旧场，提示药物使用频率和程度对细菌多重耐药的形成有直接的影响。从图中可以了解到目前养殖场分离的大肠杆菌普遍存在对抗生素的多重耐药现象，本试验中许多细菌表现出对四环素、复方新诺明、氯霉素、氨苄青霉素、阿莫西林以及阿莫西林/棒酸合剂的共同耐药，因此0-4重耐药菌所占比例很小，6重耐药细菌最多。同时一些细菌又发展出对氨基糖苷类或氟喹诺酮类药物的耐药性，所以6-10重耐药细菌成为分离细菌的主体。本试验中的10-11重耐药菌，就是对临床常用抗生素都耐药的细菌，这部分细菌所占比例也不少，应该引起我们的高度重视。
Table 1
E.coli antibiotic resistance standard of K-B method 药物名称
| 含药量
（μg/片）
| 抑 菌 圈 直 径（mm）
| R
| I
| S
| 氨苄青霉素
| 10
| ≤13
| 14-16
| ≥17
| 阿莫西林
| 10
| ≤14
| 15-17
| ≥18
| 阿莫西林+棒酸
| 20+10
| ≤13
| 14-17
| ≥18
| 氨曲南
| 30
| ≤15
| 16-21
| ≥22
| 亚氨培南
| 10
| ≤13
| 14-15
| ≥16
| 头孢哌酮
| 75
| ≤15
| 16-20
| ≥21
| 头孢唑啉
| 30
| ≤14
| 15-17
| ≥18
| 丁胺卡那
| 30
| ≤14
| 15-16
| ≥17
| 庆大霉素
| 10
| ≤12
| 13-14
| ≥15
| 链霉素
| 10
| ≤11
| 12-14
| ≥15
| 氯霉素
| 30
| ≤12
| 13-17
| ≥18
| 四环素
| 30
| ≤14
| 15-18
| ≥19
| 新诺明+TMP
| 23.75+1.25
| ≤10
| 11-15
| ≥16
| 多粘菌素
| 300u
| ≤8
| 9-12
| ≥13
| 环丙沙星
| 5
| ≤15
| 16-20
| ≥21
| 诺氟沙星
| 10
| ≤12
| 13-16
| ≥17
| 氧氟沙星
| 5
| ≤12
| 13-15
| ≥16
|
注：本表整理自美国NCCLS药敏纸片扩散法法规及操作规程
Table 2
E.coli antibiotic resistance model of old pig farm 药敏纸片
细菌总数
| R
| I
| S
|
| 细菌数
| %
| 细菌数
| %
| 细菌数
| %
| 氨苄青霉素
阿莫西林
| 75
| 69
92.0
| 4
5.3
| | 75
| | | | 阿莫西林/棒酸
60
| | | | 氨曲南
75
| 0
0
| | | 亚氨培南
64
| | | | 头孢哌酮
75
| | | | 头孢唑啉
75
| | | | 丁胺卡那
75
| | | | 庆大霉素
56
| | | | 链霉素
56
| | | | 氯霉素
75
| | | 四环素
75
| | 0
0
| | 新诺明+TMP
75
| | | | 多粘菌素
56
| | | | 环丙沙星
75
| | | | 诺氟沙星
69
| | | | 氧氟沙星
75
| | | | | | | | | | | |
Table 3
E.coli antibiotic resistance model of new pig farm 药敏纸片
细菌总数
| R
| I
| S
|
| 细菌数
| %
| 细菌数
| %
| 细菌数
| %
| 氨苄青霉素
阿莫西林
| 67
| 61
91.0
| 1
1.5
| 5
7.5
| 67
| 61
91.0
| 2
3.0
| 4
6.0
| 阿莫西林/棒酸
54
| 49
90.7
| 3
5.6
| 2
3.7
| 氨曲南
67
| 0
0
| 2
3.0
| 65
97.0
| 亚氨培南
64
| 0
0
| 3
4.7
| 61
95.3
| 头孢哌酮
67
| 0
0
| 2
3.0
| 65
97.0
| 头孢唑啉
67
| 0
0
| 13
19.4
| 54
80.6
| 丁胺卡那
67
| 7
10.5
| 0
0
| 60
89.5
| 庆大霉素
64
| 21
32.8
| 6
9.4
| 37
57.8
| 链霉素
54
| 3
5.6
56
83.5
| 0
0
| 51
94.4
| 氯霉素
67
| 3
4.5
| 8
12.0
| 四环素
67
| 65
97.0
| 0
0
| 2
3.0
| 新诺明+TMP
67
| 59
88.1
| 0
0
| 8
11.9
| 多粘菌素
67
| 0
0
| 0
0
| 67
100
| 环丙沙星
67
| 23
34.3
| 2
3.0
| 42
62.7
| 诺氟沙星
69
| 20
33.3
| 0
0
| 40
66.7
| 氧氟沙星
67
| 24
35.8
| 1
1.5
| 42
62.7
| | | | | | | | |
3讨论
3.1药物使用频率与耐药率的关系
四环素类抗生素和氯霉素类抗生素在新场使用较少，但试验结果却表明细菌对这两种抗生素有较高的耐药率，这可能与引进种猪体内携带的耐药菌群有关，据了解，新场的原种场建场时间为1998年。这同时提示我们，对这两种抗生素已经形成耐药的细菌，即使停药较长时间也不容易恢复到敏感状态。
3.2抗生素的交叉耐药性
调查发现，耐药菌株表现出了对同类抗生素的交叉耐药性，这在氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素表现得特别明显，环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星都是氟喹诺酮类抗生素，近年来其耐药率有不断积累的趋势。本次试验表明临床分离的大肠杆菌已经有相当程度的耐药率。有文献报道氧氟沙星在该类抗生素中较少诱导出耐药菌[7]，本次试验可能是由于交叉耐药现象的存在，结果显示临床分离细菌对氧氟沙星的耐药率也比较高。因此，兽医临床用药应根据药敏试验结果，有针对性地使用，同时要首先选用不容易诱导细菌产生耐药性的药物，而且必须经常更换抗生素种类，以免产生新的耐药菌株。
目前，兽医临床上抗生素的广泛、长期使用导致许多菌种的耐药性增强，这不仅给控制和治疗疾病带来困难，而且加剧了抗生素在畜禽体内的残留，严重危害动物食品安全[8]。面对世界上对抗生素在食品动物上使用的限制日益严格的趋势，加强开发抗生素替代产品成为必然，其中中草药以其低毒性、低残留、不容易诱导细菌耐药性等特点，成为许多研究的热点，今后仍然有必要加强这方面的研究[9]。同时，面对日益严重的耐药性问题，兽医临床有必要定期对猪场的常见病原菌进行药物敏感性试验，而且要加强耐药性的流行病学研究，对目前在饲料中广泛添加阿莫西林、磺胺类、四环素类药物的有效性有必要进行合理的评价。
参考文献
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畜牧与兽医，2003， 35 （3）：29-32
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北京：人民军医出版社, 2002, 63
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[9]黄一帆. 浅谈21世纪中兽医学的发展[J]. 福建畜牧兽医. 2000，（1）：15-16
基金项目：福建省自然科学基金资助项目（ ）
作者简介：俞道进（1974—），男，讲师，博士. 研究方向：兽医药理与毒理 | 
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发表于 2008-5-26 11:28:12
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