ELISA 常见问题详解

linxu406

ELISA 常见问题详解
                                          
一 OD值偏低（或阳性对照不显色）
1试剂盒从冰箱拿出后未充分平衡室温（指实验室的操作温度，20～25℃）。如果在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，可能会导致后面温育时间不够，造成OD值偏低。
2移液器吸液量不足、吸头内壁挂水太多或内壁不清洁。例如吸头与加样器未拧紧，导致吸取样品时有少量空气占据了样品的位置，使得加样量不足；加样时未预洗（把第一次吸取的样品打掉再吸），使得部分样品粘留在吸头上，造成加样量不足；加样时把样品加在孔壁上部的非包被区，导致非特异性吸附；吸头残留有样品，导致加样量不足；加样时把吸头尖部伸入液底，取出时不仅会粘到部分样品或稀释液，还容易划破包被板和引起污染。这些操作均可造成OD值偏低。
3操作顺序颠倒或遗漏步骤。如果操作人员大意或不严格按照操作步骤进行实验（如漏加酶结合物、显色剂等），很容易造成实验失败，导致整块ELISA板都不显色。
4温育时间不够。如保温用的湿盒没有预温（尤其在气温较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能会比较长），未平衡温度，会相对缩短反应时间，使OD值偏低。
5温育温度未达到要求。培养箱温度不符合操作要求，影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意这一点。
6洗板液在配置过程中出现问题。如量筒不干净，量筒或水中含酶抑制物（如叠氮钠）等；洗板液浓度太高（洗板液一般为含0.05％吐温-20的碱性磷酸盐溶液，当吐温-20浓度高于0.2％时会使结合在包被板的产物解吸附），洗去特异性结合物；配制洗板液时把别的试剂错当成浓缩洗液；配制洗板液前未充分摇匀浓缩洗液（浓缩液在冰箱保存时由于温度低下会有结晶沉淀），如果配制时吸取到结晶的话，会导致洗板液浓度升高，使得结合在包被板的产物解吸附，引起OD值偏低。
7洗板时冲击力太大、浸泡时间过长、洗板次数过多，都可能洗去结合在包被板的特异性结合物，导致OD值偏低。
８加完终止液后没有轻轻充分混匀ELISA板液就立即读数或放置太久才进行读数（一般3分钟之内进行读数），都可能使检测OD值偏低。
９酶标仪检测波长设定有误。一般酶标仪在测读吸光值时选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长，TMB用650nm波长。如果波长设定错误，可能造成OD值偏低。
10配制显色剂溶液后未及时使用，或显色剂未避光保存，或显色剂作用时间不够，或终止液错当成显色剂使用。使用前的TMB底物一般在18～25℃放置或最好在25℃放置，否则很容易使显色作用时间相对不够，造成OD值偏低。
11试剂盒没有按规定保存，受高温影响。试剂盒在运输途中时间太长，保存温度太高，影响试剂质量。一般试剂盒保存在2～8℃，保存过程中要及时清理冰箱中出现的霜或冰块，以防霜（或冰块）与试剂盒粘贴在一起导致其中的试剂由于温度下降而改变质量。
12采样时间不当。一些畜禽用药后可能对ELISA检测结果有影响，如地塞米松治疗引起的免疫抑制可降低牛结核分枝杆菌γ－干扰素对结核杆菌抗原的应答，引起OD值偏低。
13血清如在冰箱中保存过久，其中的一些蛋白质（如IgG）可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深，而且放置过久有时会造成抗原或抗体免疫活性减弱，亦可使OD值偏低。血清反复冻融也会使抗体效价跌落，造成检测OD值偏低。
14试剂失效（尤其是酶结合物、显色剂等），试剂盒过期，试剂盒循环使用次数过多。
二 OD值偏高（或全部板孔均有显色）
1实验室内温度太高（>25℃）。有些试剂盒设定的反应温度是室温（指实验室的操作温度，20～25℃），如果实验室内温度太高（特别在夏天高温天气时），会导致反应程度相对增强，造成OD值偏高。
2一次实验的样品量过多，加样时间太长，导致试剂（样品）的实际反应时间延长，OD值偏高。
3酶加量过多。如移液器不准，操作人员大意导致同一个孔重复加样，或用移液器加样时把移液器按到最底限。
4加底物时各孔间受酶污染。底物受酶催化发生颜色变化，导致OD值偏高。
5终止液未摇匀，加样时吸到有结晶的部分，使终止液浓度相对升高，导致OD值偏高。
6温育时ELISA板未盖上胶膜或未平放在底部垫有湿纱布的盒中，会使蒸发的水分很多，对于整个反应体系来说，各种反应物的浓度会不断增加，这样势必导致反应最后的OD值升高。
6温育时温度过高，酶结合物反应时间、底物显色时间过长等。
7洗涤不充分，洗后未拍干，板孔中残留有酶或其他非特异性物质等。如果洗涤不彻底（如每孔洗涤液量不够、每次浸泡时间不足、洗板次数不够等），尤其在最后一次，可能会有酶结合物的非特异性吸附或孔内多余的抗原（或抗体）不能彻底去除，造成空白值升高；在间接法中，如果血清样本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗干净，也将与酶标二抗作用而产生干扰，导致OD值升高。
8洗板液被污染。排枪洗板时未悬空加入洗液，使吸头粘到孔中的液体，造成洗涤液被污染，如污染酶等，会使后面加入的显色液发生颜色反应而使OD值偏高。
9拍板时使用易掉渣的纸，使纸屑留在孔中，由于其中含有氧化剂而造成OD值偏高。
10显色液变质。有些显色液未避光保存或配制后未及时使用，可能会产生颜色反应，导致OD值偏高。
11水质被金属离子污染。如水中含过多Ca2＋、Mg2＋，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果，导致一些非特异性显色，造成OD值偏高。一般洗涤用的双蒸水电导率应小于1.5μs/cm，洗液PH值一般在7.4±0.2。
12采样时间不当。一些畜禽用药后可能对ELISA检测有影响，如在肉猪的药物残留检测中，如果采样前使用过药物（如安乃近、支原净、磺胺六甲针、磺胺六甲粉、丁胺卡那、长效土霉素等）而未过停药期就进行采样检测，很容易引起检测OD值偏高。
13样品质量问题。黄疸血清样品中常含有内源性过氧化物酶，如果用辣根过氧化物酶作为标记物，就有可能产生非特异性显色。溶血样品，红细胞溶解破裂，会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，就可能催化底物液显色而造成假阳性。样品被细菌或霉菌等污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
14吸头重复使用，未洁净或消毒不完全而用于加酶或底物。
三 样品的重复性差
1 加错样品。重复性检测强调的是同一份样品，如果加样时加错样品，势必导致结果前后不 一致。
2 加样品及试剂时量不足或不准，造成孔间不一致，结果也会不一致。
3 加样太快，孔间易发生污染，也会造成加样量不足，导致前后结果不一致。
4 把样品及试剂加在孔壁上部非包被区。
5 加样时间有长有短，出现时差反应。特别一次实验检测样品数过多，而重复孔一个加在最前孔，一个加在最后孔时很容易造成结果不一致。或当稀释倍数较高时，如果不先进行预稀释，就会延长加样时间，导致样品间的反应时间相差过大引起结果差异。
6孔内污染杂物。如在拍板时使用易掉渣的纸，使纸屑留在重复孔中，由于纸屑含有氧化剂而造成最终的OD值不一致。
7温育时间、洗板条件、显色时间、操作人员不一致。
8酶标仪滤光片不正确。酶标仪不稳定，测定重复性差；酶标仪操作时电压不稳定，使用前未先预热15～30分钟，导致测读结果不稳定，易造成检测结果不一致。
9阙值附近时阴时阳。可同一样品做三个或多个重复孔，以两个以上相同者为准。
10不同批号试剂盒组分混用。
11血清中含蛋白、水分等多种成分，由于比重关系，静止保存时容易分层，如果加样时没有混匀血清而吸入血清的不同部层，可能会造成结果不一致。
12如果血清样品未完全凝固即加入ELISA板孔中，孔内可能出现纤维蛋白凝固或残留有血细胞，容易出现假阳性，同时会导致前后两次检测结果不一致。

伯虎再点谁

先放起来.............................

以后跟"兽医微生物"书一起看~~~~~~~~~~~~~谢谢............

cj23

1# linxu406
请问我的ELISA抗原包被不上原因有哪些，是浓度过大吗？

宁衡

考虑过ELISA板的问题吗？:hehes: