甘肃棘豆抗肿瘤活性组分筛选试验*

貔貅

柳军玺1，吴达1，2,师彦平1 ，王建华2 （1中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃省天然药物重点实验室, 甘肃 兰州 730000； 2西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

摘要:以甘肃棘豆(Oxytropis Kansuensis)提取物的乙酸乙酯部位、水相部位,以及生物碱和非生物碱部位，对荷S180和H22肿瘤小鼠进行了体内抗肿瘤实验。结果表明，被试验的四个样品中，非生物碱部位没有抗肿瘤活性，乙酸乙酯部位和水相部位对S180和H22均具有一定的抑制作用，但作用都不及生物碱部位强；各试验组小鼠的胸腺、脾脏和体重均无明显变化,这也表明四种组分样品在试验用剂量时，对小鼠均无毒性反映。 关键词:甘肃棘豆；S180；H22；抗肿瘤活性；活性筛选 The Screening of anti-tumor composition from Oxytropis kansuensis LIU Jun-Xi1, WU Da1,2, SHI Yan-Ping1Δ, WANG Jian-Hua2 (1Lanzhou Institue of Chemical Physics, CAS, Lanzhou 730000, China;2 College of AnimalScience and Veterinary Medicine, Northwest Sci.-Tech.University of Agriculture and Forestry, Shanxi Yangling 712100, China) AbstractScreening of the effective anti-tumor fractions from acetic ester fraction and water fraction as well as alkaloids fraction and non-alkaloids fraction of Oxytropis Kansuensis on mice bearing S180 and H22 in vivo. The results shown that the alkaloids fraction has obvious role on anti-tumor. To some extent, acetic ester fraction and water fraction also have effect on mice bearing S180 and H22 , but the effect of them are both inferior to that of alkaloid fraction. The weight analysis of immune organs and the gaining body-weight indicate that every treat has no toxic influence on mice and can not enhance the no-specific immune function of mice. Key wordsOxytropis Kansuensis；Sarcoma180；H22；anti-tumor effect；bioactive screening     甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis) 是西北牧区危害最严重的毒草之一，目前其研究热点是防除和综合利用［1］。 近年来研究表明,甘肃棘豆及其同属植物总提取物具有较强的抗肿瘤活性［2－4］，并认为甘肃棘豆抗肿瘤作用的主要活性与其所含的生物碱苦马豆素有关。然而，苦马豆素在棘豆中含量很低，从棘豆中提取苦马豆素的技术尚不成熟，为此研究甘肃棘豆植物抗肿瘤的活性部位显得尤为重要。     选取甘肃棘豆乙酸乙酯部位和水相部位以及生物碱、非生物碱部位对荷S180和H22肿瘤小鼠进行体内抗肿瘤活性筛选实验。结果表明试验选用的四个部位（乙酸乙酯极性部位、水相部位以及生物碱和非生物碱部位）中，生物碱部位抗肿瘤活性最强，非生物碱部位没有抗肿瘤作用，其它两个极性部位有一定的抗肿瘤活性，但作用都不及生物碱部位强。研究结果进一步表明生物碱部位为甘肃棘豆抗肿瘤的主要活性部位。 1 材料与方法 1.1动物及瘤株：     实验动物选用昆明种小鼠，6～8周龄，体重20±2.0g，雌雄兼用，每批试验采用统一性别，由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供，合格证号：医动字第14-009号；实验环境：温度20～22℃，相对湿度45～50%，环境设施合格证：医动字第14-019号；S180肉瘤购于中国医科院药物研究所。按常规方法，无菌条件下，选择生长良好的S180肉瘤，制备成细胞悬液，调整细胞浓度为1.46×106/ml，于小鼠右前腋下接种0.2ml/只。接种次日，随机将接种好的小鼠分成3组，每组为10只。抑瘤试验重复三次。 1.2实验用药物 A（乙酸乙酯萃取部位）、B（水相部位）、C（生物碱部位）和D（非生物碱部位），由中国科学院兰州化学物理研究所甘肃省天然药物重点实验室提供，参照预试验及活性筛选给药量，各样品试验用剂量分别为：A：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；B：1.0 g/kg、3.0 g/kg；C：0.25 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg；D：1.0 g/kg、3.0 g/kg。蒸馏水阴性对照组和各样品试验组灌胃给予，接种24 h后开始给药，给药量0.2ml/10g体重；环磷酰胺（CTX）：中美合资山西泰盛制药有限公司生产，批号：011121, 临时用注射用水配成所需浓度（25mg/kg），腹腔注射给药, 每日0.1ml/10g体重, 给药10 d。 1.3实验方法     所有动物每天给药一次，连续10 d，并隔日称体重一次，停药次日脱颈处死小鼠，剖取瘤块、胸腺及脾脏，并称重，计算抑瘤率、胸腺系数、脾系数增长率及体增重率。试验分批进行，各样品各剂量均进行重复试验。 肿瘤抑制率（%）=（1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%； 胸腺（脾）重量系数（mg/10g）= 胸腺（脾）重量/去瘤重量×10； 胸腺（脾）重量系数增长率（%）= [给药组胸腺（脾）重量系数/对照组胸腺（脾） 重量系数]×100； 动物增重= 去瘤体重- 起始体重； 动物体重增长率（%）= （给药组增重- 对照组增重）/对照组增重×100。 固定好的瘤块，切片后进行病理检查（HE染色）。所有数据用SPSS10.0统计软件中单因素方差分析进行统计分析。 2结果 2.1样品对小鼠移植性肿瘤S180的作用     A、B、C对小鼠移植性肿瘤S180均有明显的抑制作用，重复性较好，且统计学处理差异有显著性（P<0.05-0.001）。A抑制率为35.85%～56.25%；B为39.84%～57.03%；C为34.38～64.06%。D对S180无明显抑制作用，统计学处理差异无显著性（P>0.05），抑制率为15.09～24.53%，见表1。 2.2样品对小鼠移植性肿瘤H22的作用     A、B、C对小鼠移植性肿瘤H22均有一定的抑制作用，重复性较好，且统计学处理差异有显著性（P<0.05-0.001）。A抑制率为20.35%～48.67%；B为38.05%～41.43%；C为43.57～58.57%。D对H22无明显抑制作用，统计学处理差异无显著性（P>0.05），抑制率为20.35～24.78%，见表2。 2.3样品对荷S180、、H22小鼠的免疫器官的影响     A、B、C对荷S180、H22小鼠的胸腺、脾脏重量系数与对照组相比，经统计学处理，差异均无显著性（P>0.05）。D1.0g/kg剂量时可提高荷S180小鼠的胸腺重量系数，增长率为24.63%，与对照组相比，经统计学处理差异有显著性（P<0.05）。CTX胸腺、脾脏系数明显降低（P<0.001）。 2.4样品对荷S180、H22小鼠体重的影响     各样品在不同剂量时对荷S180、H22雌雄小鼠的体重均有不同程度的影响。 2.5各组肿瘤切片病理检查     蒸馏水阴性对照组小鼠肿瘤切片高倍镜观察: 肿瘤细胞呈团簇状密集生长,排列紧实,核较大浓染,形态各异,异型性明显，生物碱给药组和环磷酰胺组可见大面积红染无结构的坏死区，肿瘤细胞明显减少，残存肿瘤细胞大多萎缩，核深染固缩或碎裂迫向死亡，也可见个别逆转肿瘤细胞，核明显缩小，周围胞浆红染，核浆比例减小，呈规则的圆或椭圆型。组织间有炎性细胞浸润；乙酸乙酯给药组和水相部位给药组肿瘤切片也可观察到肿瘤细胞坏死。 3讨论 3.1各样品抑瘤作用分析     试验用四个样品中，非生物碱部位各剂量组每次试验抑瘤率均小于30%，按抗肿瘤药物体内筛选规程药物疗效评价标准，确认为没有抗肿瘤活性；乙酸乙酯部位和水相部位对S180和H22均有一定抑制作用，但其抑制作用都不及生物碱部位强，这可能是由于抗癌活性生物碱在这两个极性部位中不同程度分布的原因。因此，初步确定生物碱成分群是甘肃棘豆抗肿瘤的主要活性部位。 3.2各样品对荷瘤小鼠免疫器官及体重的影响     本试验按照《免疫动物筛选规程》中“免疫器官重量法”对荷瘤小鼠胸腺、脾脏进行了重量分析，结果表明各样品对荷瘤小鼠胸腺、脾脏没有明显的影响；和对照组相比，体增重率也无统计意义。说明各样品试验用剂量对小鼠没有毒性反映，也没有提高荷瘤小鼠非特异性免疫功能。 3.3肿瘤病理切片观察     肿瘤病理切片显微镜观察可见，生物碱可使S180、H22恶性肿瘤细胞出现大面积坏死。这和已报道的研究结果相吻合，认为棘豆属植物生物碱可直接杀伤肿瘤细胞。