豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞损害作用的对比

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豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞损害作用的对比 杨鸣琦*，张 黎，颜水泉 (西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100)

[摘 要]为了探索豆类丝核菌或其次级代谢产物的动植物损害在细胞生物学上的关系，为苦马豆素（swainsonine, SW）的毒理学研究提供新的研究思路。本试验通过制作豆类丝核菌次级代谢产物污染的饲料和人工污染豆类丝核菌饲料，饲喂家兔17d ,剖检家兔并取其脑、肝脏、肾脏等组织分别进行病理组织学和电镜观察；同时将不同浓度的次级代谢产物和不同株的豆类丝核菌分别污染回接的绿豆，待84h培养后，分别进行组织学和电镜观察。结果在对动植物细胞损害作用中，豆类丝核菌次级代谢产物使家兔脑组织和淋巴细胞空泡变性，神经细胞核糖体脱颗粒，粗面内质网扩张等；同时能使植物根部组织结构受损，细胞空泡变性，内膜破裂等。由此表明，豆类丝核菌引起的动物中毒作用主要是其次级代谢产物中SW发挥毒性，且同疯草中毒引起的病理变化基本一致；菌株对植物根部的致病性与其次级代谢产物中SW含量呈正相关。即推测，SW很有可能不仅是动物豆类丝核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物丝核菌病中细胞损害的主要化学物质。 [关键词]豆类丝核菌；次级代谢产物；苦马豆素；毒性 [中图分类号]：S859.8[文献识别码]A     动物的疯草中毒研究目前报道较多，而且认为疯草中毒的主要毒物是苦马豆素（swainsonine,SW）[1～3]。SW同时也被认为是豆类丝核菌污染饲料引起流涎征的主要成分[4, 5]。杨鸣琦等首次在国内分离出的豆类丝核菌，与国外报道的该菌生理、形态特性相一致，也同时发现了该菌的植物致病性和所提取的SW的抗肿瘤作用[6,7]。进一步研究发现该菌的次级代谢产物中含有大量的SW[8]。但是，运用国内分离菌污染饲料是否同样可引起动物中毒；中毒是菌体本身作用还是该菌的次级代谢产物作用；该菌的植物致病作用是否也同其次级代谢产物和SW相关；动物中毒与植物致病在细胞生物学角度上是否存在一定的关系，这些疑问目前仍未解决。因此，本试验目的在于运用病理学方法分析豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞的损害作用，并将动物中毒与植物致病作用进行比较，找到这两个作用与次级代谢产物及SW的关系。其意义在于，该试验对豆类丝核菌的毒性研究更加深入，并对豆类丝核菌引起动植物的毒害作用机理提供重要依据。 1材料与方法 1.1 主要仪器AO组织切片机：WARNER-LAMBERT TECH.INC，美国。JEM-100SX透射电子显微镜：日本JEOL公司制造。 XSZ-G型光学显微镜，重庆光学仪器厂制造。 Coolpix995型数码相机，日本NIKON公司制造。ZPQ-280B智能气候培养箱：哈尔滨东拓科技开发有限公司制造。SW-CJ-IF型医用洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司制造。1602MP8-1型电子天平（万分之一）：德国SARTORIUS COTTINGEN公司制造。 1.2主要试剂及其配制 豆类丝核菌：菌株02-6B和94-2B，由西北农林科技大学动物病理学实验室提供。次级代谢产物液Ⅰ：将豆类丝核菌 14d发酵液稀释为内含SW 0.54mg/ml，煮沸灭菌，待用。次级代谢产物液Ⅱ：将豆类丝核菌 14d发酵液稀释为内含SW 0.14mg/ml，煮沸灭菌，待用。 1.3实验动物和植物 家兔：购于陕西杨凌周边农村，体重500g左右，共9只，雄性。绿豆：购于陕西杨凌市场。 1.4动物分组     A组：饲喂次级代谢产物组，家兔3只，每天每只定时饲喂含有豆类丝核菌次级代谢产物饲料7g及胡萝卜、白菜等（每天摄入SW约为14.5mg/Kg·b），饲喂17d。B组：丝核菌污染饲料组，家兔3只，每天每只定时饲喂人工污染豆类丝核菌饲料Ⅱ7g及胡萝卜、白菜等，饲喂17d。C组：空白组，家兔3只，每天每只饲喂普通饲料7g及胡萝卜、白菜等，喂17d。 1.5实验用绿豆与分组 Ⅰ组：空白对照组，将绿豆回接于少氮半固体培养基中培养[3]，共4管。Ⅱ组：将绿豆回接于培养基的同时，在培养基中接种菌株02-6B，共4管。Ⅲ组：将绿豆回接于培养基的同时，在培养基中接种菌株94-2B，共4管。Ⅳ组：将绿豆回接于含有高浓度次级代谢产物的培养基中（含SW 270mg/L），进行培养，共4管。Ⅴ组：将绿豆回接于含有低浓度培养基中（含SW 70mg/L），进行培养，共4管。Ⅵ组：将绿豆回接于培养基中培养24h后，滴加次级代谢产物液高浓度0.4ml（含SW 72mg/L）后继续培养。Ⅶ组：将绿豆回接于培养基中培养24h后，滴加低浓度次级代谢产物液0.4ml（含SW 18.67mg/L）后继续培养。 1.6中毒家兔的组织学与电镜观察     将各组家兔于试验的第17d后处死，取血液并涂片，瑞氏染色，于1000倍油镜下观察淋巴细胞。将小脑、大脑、心脏、脾脏、肾脏用10％中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚4μm光学显微镜观察。取大脑、小脑及肝组织用2.5％戊二醛固定，制作超薄切片，片厚300?，通过透射电子显微镜观察，并记录。 1.7回接绿豆试验及其组织学与电镜观察     在无菌条件下，将绿豆用0.1％HgCl2浸泡5min,无菌水冲洗6次，再将绿豆放于含有无菌水的灭菌平皿中，于25℃普通温箱培养，每隔24h换水一次。于培养3d时将已发芽的绿豆分别接种于各组试管中，并在光照气候箱内进行培养，培养条件如下：白天5：00～19：00（14h），25℃，4级光照度；夜间19：00～5：00（10h），20℃，无光照。共计培养48h；48h后按照白天5：00～19：00（14h），22℃，4级光照度；夜间19：00～5：00（10h），15℃，无光照。共计培养36h。将回接培养完毕后的各组豆苗进行大体观察、照相；并将各组豆苗中病变部位取样用FAA固定液抽气固定，进行石蜡包埋，连续切片，片厚10μm，番红－固绿染色，光学显微镜进行观察，记录。另取培养后豆苗病变组织用4％戊二醛抽气固定，制作超薄切片，片厚600?，用透射电子显微镜观察，并记录。 2结果 2.1家兔中毒试验结果     家兔病变组织光学显微镜观察,A、B两组家兔，经17d培养后，血涂片中淋巴细胞均出现轻度空泡变性，C组血涂片中未见异常。A、B两组小脑浦肯野氏细胞空泡变性，并出现卫星化及噬神经现象；大脑有个别神经细胞出现核浓缩、卫星化现象，并有小胶质细胞及神经细胞的空泡变性（见照片1）；毛细血管周围水肿；肾间质瘀血，肾小管颗粒变性；肝脏瘀血，颗粒变性，个别动物出现脂肪变性；此外，心肌颗粒变性及胆管增生，并以第A组更为明显。     家兔病变细胞电镜观察,A组脑组织中神经细胞皱缩，密度增大，个别神经细胞肿胀，内质网扩张，核糖体脱颗粒（见照片2），脑组织血管内皮水肿；B组中脑组织除以上情况外，还可见吞噬细胞溶酶体增多，出现噬神经现象。A、B两组肝组织窦内出现嗜中性粒细胞，毛细胆管扩张，肝细胞线粒体散在存在，且糖原增多，肝脏枯否氏细胞溶酶体增多。 2.2回接绿豆试验结果     大体观察，Ⅱ～Ⅶ组豆苗中根部均有不同程度出现褐斑、萎缩，其中Ⅳ组豆苗生长完全抑制，根部只有主根无须根，且主根萎缩，溃烂，颜色变褐。除Ⅳ组外，在褐斑等病变程度上Ⅱ、Ⅵ组病变程度较Ⅲ组和Ⅴ组严重，而Ⅶ组病变程度最轻，几乎无病变与Ⅰ组（对照组）情况接近。     光学显微镜观察，Ⅱ～Ⅶ组豆苗根部横断切片中表现为疏导组织、导管或筛管中有侵填体产生，部分出现细胞结构破损，细胞坏死。在病变程度上Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ三组侵填体产生较多，维管束病变程度大，细胞坏死数量多，而Ⅲ、Ⅴ组相对病变程度较轻；Ⅶ组病变程度最轻，与大体观察结果相一致。     透射电镜观察，Ⅱ～Ⅶ组根部细胞多表现为空泡变性，细胞坏死，细胞结构消失，由此细胞的细胞壁破裂或线粒体游走并进入液泡中（见照片3）。而Ⅳ组则表现为广泛的细胞坏死（见照片4）。Ⅵ组还表现出细胞内膜破裂，叶绿体固缩、颜色加深及叶绿体空泡变性。 3讨论 3.1豆类丝核菌次级代谢产物对家兔的毒性作用     在本次试验中，经饲喂含有豆类丝核菌（A组）或其次级代谢产物（B组）的饲料17d，均未出现临床症状，但经病理组织学及电镜观察，家兔的脑、肝、肾、血都有不同程度的细胞病变，而淋巴细胞、小脑浦肯野氏细胞及大脑的小胶质细胞与神经细胞的空泡变性，则与家畜疯草中毒的病理学变化相同，而且表明该次级代谢产物或真菌的中毒主要是由SW引起的，并且再一次表明SW引起的动物中毒具有一定的贮积作用，属于慢性中毒，并与国外在疯草中研究SW的中毒表现是一致的[3]。而A、B两组虽然A组为直接运用含SW的次级代谢产物，B组为人工污染豆类丝核菌，但在家兔中毒中病理学变化来看是基本一致的，它不但表明该菌污染饲料和国外报道的[9～11]豆类丝核菌引起动物的中毒相似，而且还表明豆类丝核菌污染引起动物中毒主要是由其产生的次级代谢产物所引起的。此外，在病理组织学变化中脑组织毛细血管水肿，肾小管颗粒变性，心肌颗粒变性及肝脏瘀血、颗粒变性等则同样与文献[12～14]中家兔、羊、小鼠的疯草中毒表现相似，也同样表明SW除了对以脑组织为主的神经系统进行损害外，还能对心、肝、肾等重要器官的组织细胞进行损害。     结合电镜观察结果，神经细胞的皱缩、细胞密度增大及组织学和电镜中均观察到的噬神经现象表明，该次级代谢产物的神经毒害作用，可导致神经细胞的坏死。粗面内质网是细胞体内的重要的蛋白质合成器官，上面附着的核糖体则主要产生分泌型蛋白质及膜表面的功能及构型蛋白质，而神经细胞的内质网扩张及核糖体的脱颗粒，则表明这些神经细胞的损伤与坏死与其蛋白质合成代谢障碍有关，特别是膜表面的蛋白质合成受到影响，而膜表面蛋白除了起到结构蛋白的作用外，还是多种离子与营养物质运输的通道，因此推测含有SW的次级代谢产物可使整个神经细胞的营养代谢造成紊乱。此外，在电镜观察中还发现吞噬细胞内溶酶体的增多，这可能与SW的α-甘露糖苷酶抑制作用有关，从而导致部分合成的低聚糖及糖蛋白在溶酶体内的聚积，即导致机体的溶酶贮积病。脑中毛细血管周围的水肿则表明脑组织中低聚糖增加，引起了组织渗透平衡紊乱。同时，SW还可能发挥有影响机体能量代谢的作用，即表现在肝细胞的线粒体减少而糖元的增多上。     由此可见，豆类丝核菌引起的动物中毒作用主要是其次级代谢产物发挥毒性，而其中主要以SW的作用为主，并且同疯草中毒引起的病理变化基本一致。而SW在中毒中发挥的作用不但影响了机体中其靶细胞的物质运输，同时还影响细胞的能量代谢，从而导致细胞病变。 3.2豆类丝核菌次级代谢产物对绿豆苗的致病作用     从大体观察看，无论是直接接种豆类丝核菌还是通过不同方式直接运用其产生的次级代谢产物，植物根部均能表现出褐斑及溃烂，而在高浓度次级代谢产物组（含SW 270mg/L）中豆苗的生长完全受到抑制。由此可以看出，该菌的植物致病作用和动物中毒相似仍然是次级代谢产物发挥主导作用。在组织学观察中，Ⅱ～Ⅶ组中均有不同程度的维管束病变，植物的疏导组织、导管或筛管均有侵填体产生，并伴有部分细胞的破损、坏死，从而表明，该代谢产物导致植物的水分和营养物质运输受阻。而在Ⅳ～Ⅶ组中，无论何种方式在培养基中添加次级代谢产物，随着该次级代谢产物浓度的增加（SW浓度的增加），病变程度越重，侵填体越多。即表明该代谢产物在培养基中的浓度与病变程度呈正相关。除此以外，Ⅱ组植物根部的病变情况明显比Ⅲ组严重，虽然都是接种豆类丝核菌，但菌株不同，病变程度也不尽相同（Ⅱ组为02-6B株，Ⅲ组为94-2B株），即表明02-6B菌株致病性比94－2B菌株致病性强，而由第三章中各菌株次级代谢产物中SW含量看，02-6B的SW含量同样高于94-2B的含量，即表明菌株的致病性与其次级代谢产物中SW含量呈正相关。 3.3豆类丝核菌次级代谢产物对动植物细胞损害的对比     从动植物细胞的超微结构上来看，绿豆根部细胞病变同动物中毒后神经细胞病变一样，出现空泡变性，即SW细胞损害作用的特征病变，并结合SW含量与植物致病性的正相关作用在本次试验中的体现，推测该次级代谢产物的植物致病作用仍与其中的SW有关。而植物细胞的细胞壁与内膜的破裂则与动物中毒中所推测出的及文献[15]报道的SW对动物细胞膜表面蛋白结构的损害作用有一定的相似性，即推测在植物中，可能仍是由于SW的作用导致甘露糖苷酶Ⅱ受到抑制，从而使膜表面蛋白及细胞骨架合成障碍，从而破坏其结构。而在植物中侵填体增加与动物细胞中糖元蓄积、粗面内质网扩张、脱颗粒等的作用结果均是营养物质运输的受阻所致。在植物中重要的能量产生单位――叶绿体，在次级代谢产物的作用下出现了固缩、颜色加深及叶绿体内的空泡变性，这一病理变化是在没有叶绿体的动物细胞中无法见到的。而在动物细胞中吞噬细胞溶酶体增多也是无法在没有免疫吞噬细胞的植物中发现的。但有一点可以肯定，那就是该次级代谢产物对动植物细胞的总体作用均是阻断了或抑制了细胞正常的物质运输及能量代谢。虽然动物的SW中毒已基本确定为其甘露糖苷酶的抑制作用所引起的细胞代谢紊乱[16]，而在植物的致病中目前对此仍无报道，但是从豆类丝核菌次级代谢产物作用后细胞内超微结构的病变与动物细胞病变有一定的相似性上看，SW仍在植物致病中发挥作用且和在动物中毒中发挥作用相同，即推测，SW很有可能不仅是动物豆类丝核菌中毒的主要毒素，而且是豆科植物丝核菌病中细胞损害的主要化学物质。而要真正确定这一推论，并深入研究SW在动植物细胞中对代谢具体途径的影响，以及该次级代谢产物中SW以外生物碱在动物中毒与植物致病中发挥的作用等一系列问题仍有待进一步研究。