北京鸭胆囊收缩素cDNA克隆与序列分析

貔貅

董虹1，张永东1，刘凤华2，许剑琴1 （1中国农业大学动物医学院北京海淀100094，2 北京农学院动科系北京昌平 102206）

摘要：根据GenBank上登陆（登陆号为GGA251273）的鸡胆囊收缩素（CCK）基因，设计了一对特异性引物，从鸭腺胃、十二指肠和空肠提取总RNA，通过反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增，将从十二指肠和空肠中扩增出的产物克隆到pGEM-Teasy载体上，并导入大肠杆菌JM109，阳性克隆经双酶切鉴定后，进行测序和序列分析。结果腺胃未能扩增到目的片断，其它两组织都扩增到长度为220bp，编码胆囊收缩素的cDNA。与鸡的胆囊收缩素核苷酸序列相比较，同源性为88.6%。 关键词：鸭胆囊收缩素；克隆；序列分析     胆囊收缩素（CholecystokininCCK）是由胃肠黏膜Ｉ细胞分泌，33个氨基酸组成的多肽类激素，具有收缩胆囊和刺激胰酶分泌，促进胃酸、胰液的分泌，增强胰酶活性，刺激胃肠平滑肌收缩，促进远端十二指肠和空肠的蠕动及降低食物消化、延缓胃排空等功能[1]。中医上脾乃“后天之本”，具有运化水谷精微，运化水湿的功能。脾失健运，则消化吸收功能失职，出现一系列与消化障碍有关的疾病。研究显示[2]脾虚不同阶段胆囊收缩素分泌不同，提示CCK可做为脾虚证的一个客观性和特异性指标。本试验运用RT-PCR技术成功地克隆了北京鸭CCK基因片断，不仅为进一步研究鸭CCK基因的全序列及其在鸭体内的分布奠定基础；同时也为从分子水平探讨脾虚与CCK之间关系，进一步探究健脾消食中药促进动物生长的机理奠定基础。 1.材料与方法 1.1试验动物     健康30日龄北京鸭，颈动脉放血后采腺胃、空肠和十二指肠，液氮速冻，-80℃保存备用。 1.2工具酶和试剂     JM109、pGEM-T Easy Vector 试剂盒、EcoRⅠ等限制性内切酶及M-MLV 反转录酶、T4-DNA连接酶、X-gal、IPTG为Promega公司产品，DNA Marker、Taq DNA聚合酶、琼脂糖为上海生工生物工程公司技术服务有限公司产品。质粒纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品。总RNA小量提取试剂盒和胶回收试剂盒为博大泰克产品。 1.3引物的设计 参照GenBank中已登陆的鸡CCK基因序列，设计了一对引物。 上游引物：5’ATT ATT GAT AGC TCC CAG GAC AGT-3’ 下游引物：5’-GAG GTG GCT CAG CAG TTC ATC-3’ 引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。 1.4鸭腺胃、空肠、十二指肠CCK总RNA提取及cDNA第一条链的合成     30日龄北京鸭颈动脉放血，取腺胃、空肠和十二指肠，液氮速冻，采用博大泰克公司总RNA提取试剂盒，分别取组织50mg，加入玻璃研磨器中，吸入预冷的变性剂，冰浴研磨至无明显组织块，醋酸钠溶解分离，酚－氯仿－异戊醇抽提，异丙醇沉淀，适量双蒸水溶解总RNA，用微量核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，取2μgRNA，10mM dNTP，25单位Rnasin 抑制剂，200单位MMLV逆转录酶，25μL反应体系中合成第一条链。 1.5北京鸭CCK cDNA部分片段的扩增     50μL反应体系中加入1.0μLcDNA为模板，25Mm MgCl2 4.0μL，5U Taq-DNA 0.125μL、10×buffer 5.0μL、10mM dNTPs4.0μL、12.8pmol上下游引物各2.5μL，反应液在95℃预变性5min，94℃变性50s、52.8℃退火40s、72℃延伸40s、共31个循环，最后72℃保温8min。PCR结束后取取20μL进行电泳鉴定。 1.6基因克隆     扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳，通过与DNA分子量标准对照检测后，将含有目的片段的琼脂块切下，采用玻璃奶法回收法，将回收产物连接到pGEM-T载体，转化到JM109感受态细胞中，并涂布于含IPTG、X-Gal和氨苄青霉素（AMP）的LB培养基，37℃过夜培养，进行篮白斑筛选。挑取生长良好的白色菌落接种于含AMP的SOC液体培养基扩增培养。按照碱裂法提取质粒，进行酶切鉴定。 1.7重组质粒的酶切鉴定     将筛选的阳性重组质粒用EcoRⅠ进行双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外观察，酶切鉴定正确的质粒，原菌液过夜摇菌饱和后，送上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定，并将测得的CCK基因序列与鸡的进行比较分析。 2.结果 2.1 RT-PCR     用微量核酸蛋白检测仪测定提取的CCK 总RNA含量，其A260/280比值均在1.7-2.0之间，证明提取的RNA较纯。RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定。鸭空肠和十二指肠均扩增出长度为220bp左右，与设计结果大小完全相符的目的片断（见图1）；鸭腺胃中未扩出目的片断。 2.2重组质粒的鉴定     将纯化的PT-PCR产物连接pGEM-T载体中，转化E.coli感受肽细胞JM109中，培养后提取质粒用EcoRⅠ对质粒酶切鉴定，结果得到了与预期大小一致的约220bp的片断，见图2。 2.3测序结果及对比分析 测序发现，插入pGEM-T载体的PCR产物全长693bp。其中CCK基因长度为220bp，和鸡核苷酸序列相比较，同源性为88.6%，测序结果见图3。 Duck-cckTACTCCTCCTAAAGAACAGCAGACTATAGCAACAAGAAAA40 Chick-cck----------------------g-g---------g----g40 Duck-cckAAAAAATCACACTCCTATGCCTGTACAGAAAGAAAAAA..78 Chick-cck--...--g-------c---t----------g--g----at77 Duck-cckTAATTTGTTGTCCTCTTTAAATTAGTGTTTTAAATTATAT118 Chick-cck-----------------cg---c-----------gc----117 Duck-cckCATGTATTTGATGTAAATTTGTCTGTAAGATTATACAATG158 Chick-cck------------------------------.....-----152 Duck-cckCAATATATACATATGCAGAATTTTCCAG..AAAATGTTTT196 Chick-cck----------------------------ga----------192 Duck-cckCTTTCTTTTGTGGTTTCTCATACGCTGA224 Chick-cck----------------------------220 3.讨论     胆囊收缩素是1928年首先由Ivy和Oldberg在小肠粘膜提取液中发现，并最先证实它可引起胆囊收缩，故命名为胆囊收缩素。1943年Harper和Raper从小肠黏膜分泌物中提取了一种刺激胰腺酶分泌的刺激物质（CCK），称之为肠促胰酶素因子，认为它是一种潜在的胰腺酶分泌刺激因子。后来，Dockray等又在羊脑中提取出CCK，发现它是目前在脑中含量较多的一种肽类物质，并证明是一种典型的脑-肠肽类物质[3,4]。CCK是一个在生物进化中被保留下来古老的肽类，多存在于脊椎动物如圆口类、硬骨鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等动物脑和小肠黏膜的分泌细胞中，其中以大脑皮层浓度最高，甚至在无脊椎动物体内亦含有[5]。目前国内外还未曾有人报道从鸭体内分离提取CCK基因，本试验成功的从30日龄的北京鸭体内克隆出CCK基因片断，和鸡的CCK核苷酸相比较，同源性为88.2％，证明其确实为CCK基因，这也为获得鸭全长的CCK基因奠定了基础。     作为胃肠激素和神经肽[6]，CCK广泛分布于消化系统，中枢、外周神经系统，外周血液和一些组织器官中。消化系统中CCK主要以大分子形式存在，由主要分布于十二指肠及空肠上段的肠绒毛和肠腺上皮的Ⅰ细胞分泌，DannyM.Hooge等[7]研究表明CCK在鸡体内，十二指肠含量最高，其次为空肠、回肠和脑皮质。鸡的下丘脑、胰腺、胆囊及盲肠膜中也检测到特异性结合物CCK-8S（CCK-8的硫酸盐形式）。中枢系统中CCK以CCK-8活性片断形式存在，其分泌细胞主要分布于室旁核与室上核。本次试验初步探明北京鸭十二指肠和空肠含有CCK，但腺胃中却未能扩出CCK基因，提示腺胃中可能没有CCK存在。但有报道CCK分泌和动物的年龄有一定关系，不同年龄阶段CCK分泌不同，故是否此次选取的30日龄鸭在此年龄阶段无CCK分泌，还需进一步探讨。     脾具有消化吸收运输营养物质及水湿的功能，机体的各脏腑、四肢百骸、筋肉、皮毛，均有赖脾的运化以获取营养。因此脾功能失常，会出现腹胀、腹泻、营养不良等症状。而脾与胃肠激素的关系：刘芳等[2]研究表明，脾虚早期会导致组织和血浆CCK含量升高，胰液分泌增多，促进小肠运动和抑制胃运动作用加强，动物表现为纳差、腹泻；脾虚后期CCK含量下降，促进胆囊收缩和胰液分泌作用下降，对小肠运动刺激作用减小，动物表现为腹泻停止，排便粘滞。同时多部位激素含量的观察表明脾虚证时血浆、肠道和下丘脑组织中CCK的变化趋势是不一致的，可推测不同组织和血浆中CCK对脾虚失健运的作用是不一致的。由此可见CCK可作为脾虚证的一个客观性和特异性指标，因此通过探明鸭CCK基因序列，可以建立一种快捷的通过检测CCK来评价动物脾虚病理状况的方法。     健脾消食类中药具有健脾益气，促消化、助生长的作用。研究表明[8]健脾消食中药党参、山楂可促进胰液分泌，提高胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活性，促进食物消化吸收，从而促进动物增长，提示健脾消食类中药可能是通过对胃肠激素（CCK）的调节来达到促进胰腺外分泌。本试验为从分子水平研究健脾消食中药与胃肠激素之间关系提供理论基础，也为进一步研究和开发中药饲料添加剂奠定基础。

宁衡

不错的资料，不过给自己加分啊？