白头翁不同提取物及复方的体外抑菌试验研究

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	白头翁不同提取物及复方的体外抑菌试验研究 时维静  路振香  李立顺 （安徽科技学院　安徽 凤阳　233100）
	摘要：目的：探讨白头翁汤的体外抑菌作用，旨在为临床用药提供依据。方法：用蒸馏法从白头翁根中得到原白头翁素，用乙醇提取纯化法得到白头翁总皂苷，用煎煮法得到白头翁浸膏，分提白头翁汤各组成药物，合煎白头翁汤。将它们配制成1:1、1:2、1:4梯度浓度的溶液。用K-B纸片扩散法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌进行抑菌试验。结果：白头翁不同提取物、白头翁汤的组成药物对以上细菌均有抑菌作用。结论：白头翁的原白头翁素抑菌效果最好。复方抑菌作用不是各组成药物作用的相加。 关键词：白头翁汤；原白头翁素；白头翁总皂苷；白头翁浸膏；体外抑菌     白头翁汤源自《伤寒论》，由白头翁15g、黄柏12g、黄连6g、秦皮12g组成[1]。具有清热解毒、凉血止痢的功效，为中医临床治疗热痢下重的主要方药。     白头翁汤的君药白头翁为毛茛科多年生白头翁属植物白头翁的根茎。白头翁的化学成分主要为皂苷和内酯等成分。其中包括白头翁皂苷A、B、C、D (pulchinenoside A、B、C、D),皂苷1(saponin1)、皂苷2(saponin 2),白桦酯酸(betulinic acid),白桦脂酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(betulinic acid 3-O-α-L-arabinopyranoside),3-氧代白桦脂酸(3-oxobetulinic acid),胡萝卜苷(daucosterol),原白头翁素(protoanemonin),白头翁素(anemonin),白头翁灵(okinalin,C32H64O2),白头翁英(okinalin,C4H6O2)等[2]。白头翁药材的多成分决定了其治疗作用的多靶点与多层次。本文将白头翁根的三种不同的提取物：原白头翁素、白头翁总皂苷、白头翁浸膏，进行体外抑菌试验，旨在揭示白头翁汤中君药的抗菌作用的有效部位。为临床用药提供依据，以便更针对性的选择提取方法。     白头翁汤中的黄连、黄柏含巴马丁(Palmatine)小檗碱(berbenine) 药根碱(jatrorrhizine)，秦皮含七叶内酯(esculetin)秦皮甙(fraxin)七叶甙(escnlin)等。为白头翁汤发挥药效的主要物质基础。由于汤剂化学成分的复杂性和不稳定性，对复方药效的研究也是多方面的。本项试验采用分提白头翁汤各组成药物与合煎白头翁汤，制成不同梯度的药液进行体外抑菌试验，旨在为临床应用白头翁汤提供理论依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1药材与试剂     药材白头翁、黄连、黄柏、秦皮均购自亳州沪樵中药饮片厂。品种经安徽技术师范学院中药实验室鉴定，白头翁为毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel.的根;黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinensis Franch.的根茎饮片;黄柏为芸香科植物黄蘖Phellodeneron amurense Rupr.去栓皮的树皮;秦皮为木犀科植物白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.的枝皮。营养琼脂(中国医药集团上海化学试剂公司)。所用试剂均为分析纯。 1.1.2菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌均由安徽技术师范学院微生物实验室提供。采用普通营养琼脂培养基。 1.1.3 仪器     循环真空水泵，SHZ-3型，上海华光仪器表厂；真空干燥箱，ZK-82B型，上海市实验仪器总厂；电子控温电热器，蚌埠市恒信实验仪器技术研究所；高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂；电子分析天平，FA1004型，上海精科天平仪器厂；粉碎机，JFSD-100型，嘉定粮油检测仪器厂；游标卡尺，规格（0～150）㎜×0.02㎜,安徽桐城量具厂生产。索氏提取器、回流冷凝装置、蒸馏装置等，滁州千秋玻璃厂。 1.2方法 1.2.1白头翁三种提取物的提取方法 原白头翁素的提取     将100克白头翁生药根，粉碎成粗粉,加水500ml于水浴上蒸馏，至无浓的刺激味.馏液放冷，加入约5%的食盐，用100ml氯仿分次提取，合并提取液。在水浴上回收氯仿100ml，得黄色油状物约5ml(加入0.1ml冰醋酸作稳定剂)，即为原白头翁素。 白头翁总皂苷的提取     取白头翁100g，粉碎成粗粉，分次于索式提取器中，以乙醚回流脱脂，脱脂后的药粉，晾干，用95%的乙醇600ml，回流6小时，趁热过滤，药渣用200ml 95%的乙醇洗涤两次，合并滤液。减压浓缩至30ml，加入80ml丙酮，即析出白色粉质。再使其溶于热醇60ml，过滤，将滤液滴入到丙酮-乙醚（1:1）的混合溶剂中，有白色粉质沉淀析出（反复处理两次）。滤集白色粉质，于80℃真空干燥干燥，得白头翁总皂苷约9g，备用。 白头翁浸膏的提取     取白头翁粗粉100g，加水600ml，煎煮提取，第一煎1h，第二煎45min，第三煎30min，趁热过滤。合并滤液，减压浓缩至稠膏状，于80℃真空干燥，即得浸膏约27.2g。 1.2.2白头翁三种提取物不同浓度溶液制备：     由于抑菌实验选用的是不同提取物，因此须计算为同一当量进行抑菌实验比较,既配制成相当于1克生药溶于1ml水中的1:1浓度溶液。 原白头翁素液的配制：     100g白头翁生药制得原白头翁素约5ml，即0.05毫升相当于1g生药。取0.5ml原白头翁素粗品（相当于10g药材）溶于10ml水中，即得1:1浓度的原白头翁素液。 白头翁总皂苷液的配制：     100g白头翁粗粉制得白头翁总皂苷9g，0.09g白头翁总皂苷相当于1g原药材。取0.9g白头翁总皂苷（相当于10g原药材）溶于10ml水中，即得1:1浓度的白头翁总皂苷液。 白头翁浸膏液的配制：     100g白头翁粗粉制得27.2g浸膏，0.272g浸膏相当于1g原药材。取2.72g白头翁浸膏（相当于10g原药材）溶于10ml水中，即得1:1浓度的白头翁浸膏液。     从上述三者的1:1浓度的溶液中各取5.0ml于小玻璃瓶中，用梯度浓度配比法配成浓度分别为1:2、1:4的各提取物的水溶液。具体步骤为：取1:1浓度2.5ml加入第二个小瓶中，再放入2.5ml蒸馏水，充分混匀，即为1:2浓度；再从1:2浓度的瓶中取出2.5ml溶液加入第三个小瓶中，再加入2.5ml蒸馏水，充分混匀，即为1:4浓度溶液。 1.2.3白头翁汤分提与合煎溶液的制备     取白头翁、黄柏、黄连、秦皮各20g，加水120 ml分别单独浸泡30min，回流提取二次，每次30min,合并两次滤液，均浓缩至20 ml（1:1）备用。     取白头翁15g、黄柏12g、黄连6g、秦皮12g（共45g）加水270ml 。浸泡30min，回流提取二次，每次30min，合并两次滤液，浓缩至45 ml（1:1）备用。     取上述白头翁、黄柏、黄连、秦皮、白头翁汤1:1浓度提取液，按上述梯度浓度配比法配成浓度分别为1:1、1:2、1:4的各提取物的水溶液。 1.2.4抑菌试验 药敏纸片的制备：     将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径为6.0mm，置于干燥洁净的试管内，放入高压灭菌锅中经121.3℃、15-20min高压灭菌后，取出放入恒温干燥箱内进行干燥。取经干燥后的纸片一定数量，放入白头翁根的三种提取物不同浓度溶液中和白头翁、黄柏、黄连、秦皮、白头翁汤不同浓度溶液中，浸润后备用[3]。 培养基的制备：     在容量为1000ml的三角烧瓶中加入蒸馏水1000ml，放在电炉上加热。用天平准确称取35.0g营养琼脂，放入三角烧瓶中并不断搅拌使琼脂完全溶解，然后放入高压灭菌锅中经121.3℃、15-20min高压灭菌，取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约3～5mm，冷却凝固后备用。 参照菌株的培养：     在无菌操作条件下，用接种环取大肠杆菌菌株一环，用划线法接种在制作好的培养基中，然后用不同接种环分别以同样方法对金黄葡萄球菌，绿脓杆菌，副伤寒杆菌进行接种。把各菌种置37℃恒温培养箱中进行培养24h，24h后取出放入4℃冰箱中保存备用。 体外抑菌试验：     分别取上述菌株的新鲜培养物，在无菌操作条件下，用不同涂布棒均匀涂抹在接种过不同菌种的琼脂培养基上，再用无菌镊子，将在各不同浓度的药液中浸润的纸片均匀间隔贴于各琼脂培养基表面，轻压纸片使接触良好，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出，观察抑菌圈，测量并记录结果。判定标准：抑菌圈直径小于9㎜为低度敏感；9.1～11㎜为中度敏感；11.1～15㎜为高度敏感。 2结果 2.1白头翁三种提取物抑菌试验结果（略）     从表1可知：原白头翁素的抑菌效果明显，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌较为敏感。对大肠杆菌作用较弱。（注：另做乙酸对照实验证明原白头翁素中所加乙酸无抑菌作用）；白头翁总皂苷有一定的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌均有抑菌作用，低浓度时抑菌作用较弱；白头翁浸膏液抑菌效果介于两者之间，有浓度依赖关系。 2.2白头翁汤及各组分不同浓度抑菌结果（略）     从表2可见, 四药单提中黄连对金黄色葡萄球菌高敏，对大肠杆菌抑菌作用中等；秦皮对副伤寒杆菌高敏，绿脓杆菌中敏；黄柏和白头翁1:1浓度时对四种菌达中敏。从复方合煎抑菌作用看，白头翁汤的抑菌作用不是各组成成分效果的加和。对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用不如黄连，对副伤寒杆菌的抑菌效果不如秦皮。 3讨论     原白头翁素又名原白头翁脑，原银莲花素，为淡黄色油状液体，有刺激性，在碱性中易被破坏，在pH4-5条件下稳定。其沸点为45℃（1.5mmHg），由于其属于挥发油类成分，因此目前常用水蒸气蒸馏法制备。白头翁皂苷是原生苷，因苷类是往往与能水解苷的酶共存，常用的方法是甲醇、乙醇或沸水法[4]。浸膏系指用适宜的溶剂浸出有效成分，蒸去全部溶剂并调整浓度至规定标准而制成的剂型[5]。     试验结果表明：白头翁根的三种不同的提取物原白头翁素、白头翁总皂苷、白头翁浸膏液均有着不同程度的抑菌作用。且它们的抑菌效果随着浓度的增加而增强，三者的抑菌效果以原白头翁素为佳。它们对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌较为敏感，对大肠杆菌作用相对弱一些。白头翁还有很好的抗阿米巴原虫、阴道滴虫作用，现代研究还具有抗肿瘤和提高免疫功能的作用[6]。     白头翁汤为治热毒痢疾的首选方，从白头翁汤合煎与拆方抑菌试验表明：白头翁汤的抑菌作用不是各组成成分效果的加和。白头翁汤对金黄色葡萄球菌的抑菌作用不如黄连；对大肠杆菌的抑菌作用不如黄连、黄柏；对副伤寒杆菌的抑菌效果不如秦皮。提示本方对痢疾的疗效并非主要是通过抗菌作用实现的。有试验表明白头翁汤能显著降低血浆内毒素的作用[7]。本项试验也说明，中药复方的解毒、凉血作用不能单纯用抑菌作用解释[8]。