黄芩白术对LPS诱导流产小鼠的保胎作用及子宫内IL-10含量的影响

貔貅

钟秀会，史万玉，宫新城，翟向和，张铁，马爱团，褚素敏 （河北农业大学动物科技学院，保定071001）

摘要：本试验用细菌脂多糖（LPS）尾静脉注射（每鼠0.1μg），诱导昆明小鼠流产，ELISA（酶联免疫）方法测定子宫匀浆中IL-10（白细胞介素-10）的含量。发现LPS诱导流产小鼠子宫内IL-10含量降低。PXF或黄芩白术显著抑制LPS的作用，使母鼠胚胎吸收率降低，子宫中IL-10含量回升。试验结果表明，PXF或黄芩白术的保胎作用与上调子宫胎儿界面Th2细胞因子IL-10的含量有关。 关键词：细菌脂多糖；PXF； IL-10；中药；流产 中图分类号：S853.7 文献标示码：A文章编号：0366-6964（2005）0 （本文已经被畜牧兽医学报录用，2005年5期发表）     机体免疫系统能够成功地排斥异体组织移植物、并有效地清除侵入体内的各种病原。那么，胚胎在发育过程中，由于带有来自父体的基因，会表达父体抗原。这种带有一半同种异体抗原的胎儿理应受到母体免疫系统的排斥。然而，事实上正常妊娠的母体对胎儿并不表现排斥反应。这不仅是由于胎盘屏障的保护作用，更重要的是，在母体胎儿界面产生的免疫调节因子有保护胎儿的作用［1］。     尽管如此，妊娠并不象人们所期望的那样一帆风顺。哺乳动物已着床的胚胎至发育到正常分娩期间，约有40～60%会发生胚胎丢失，其中2/3(约67%)发生在妊娠早期，这在人和家畜均如此［2］。生殖免疫学观点认为，这些胚胎丢失或流产与妊娠母体Th1细胞因子反应增强有关[3]。Th1细胞因子反应以细胞免疫功能增强，产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子为特征，对妊娠有负面影响［4］。IL-2，TNF-α，IFN-γ增多，均可导致孕鼠流产［5］。白细胞介素-10（IL-10）属Th2细胞因子，有保护胎儿、促进胎盘生长等作用［4］。     试验证明，细菌产生的内毒素细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)静脉注射可诱导多种品系的孕鼠流产［6］。并发现LPS诱导流产与子宫内产生TNF-α有关［5、6］。LPS诱导流产(或胚胎吸收)与子宫内IL—10含量有何关系?值得研究。     中药黄芩白术配伍，被历史上金元时期的名医朱丹溪誉为“安胎圣药”。许多安胎方剂中均伍用黄芩白术。其安胎效果已被千百年来的医疗实践所证明。但从生殖免疫学角度分析，黄芩白术在母体子宫与胎儿界面发挥怎样的调节作用鲜见前人研究报道。     本试验用LPS诱发母鼠流产，ELISA方法测定子宫匀浆Th2细胞因子IL~10的含量，从分子免疫学角度分析了LPS诱导流产的机理，以及TNF-α阻断剂PXF和黄芩白术的保胎效果。? 1材料和方法? 1.1 试验动物?     8周龄~10周龄未经产昆明小鼠，常规饲养，每日光照12h，自由采食和饮水。经适应环境1周后，阴道涂片法进行发情鉴定。发情母鼠与公鼠1：1合笼过夜，次日清晨检出阴栓者，定为孕0d。 1.2药物及试剂?     LPS，美国Sigma公司产品(由大肠杆菌制备)。用pH7.4、0.01M的PBS稀释成0.5μg/ml(PBS经细菌滤器过滤)，置4℃冰箱中备用。     黄芩白术汤，市售中药饮片黄芩白术，按1：1混合，切碎，加自来水浸泡1h。水煎2次，合并滤汁，浓缩至每ml含生药1g。?     小鼠IL-10 ELISA测试盒，美国Endogen公司产品。?     Pentoxifylline(PXF)，美国Sigma公司产品，溶于过滤的PBS（5.75mg/ml）中。? 1.3动物分组及处理?     试验分5组（每组动物数见表1）。A、B、C、D组母鼠于孕7d时尾静脉注入LPS 0.1μg(0.2ml)，E组注入PBS 0.2ml。B组小鼠于孕5、6、7d各腹腔注射PXF，每鼠每天1.15mg。C组小鼠于孕5、6、7d各灌服黄芩白术汤1ml。D组小鼠各灌服PBS 1ml(见表1)。所有试验鼠均于孕9d剖杀。 1.4胚胎吸收率(死亡率)和流产率计算?     发生吸收或死亡的胚胎体积变小，颜色紫黑，出血坏死，甚者溶化成血团块。尸体解剖镜下观察模糊一片，没有胎膜结构。正常胚胎个体较大，粉红色。镜下观察胎膜及胎儿轮廊清晰，透光度好、无出血、瘀血现象。?     胚胎吸收率按下述方法计算［7］。即：R/(V+R)×100%?R为被吸收的胚胎数，V为活的(Viable)胚胎数。?     流产率=发生流产的母鼠数/试验组母鼠总数×100%? 1.5子宫IL-10的ELISA测定     孕鼠均于孕9d时颈椎脱臼致死。每鼠取左侧子宫角的1/2，作为免疫组织化学染色用（结果另报）。取右侧子宫角和左侧子宫角剩余的1/2匀浆。剪除子宫系膜及脂肪，纵向切开子宫角，剥去胎儿。剪碎子宫角，加入含PMSF(蛋白酶抑制剂)0.75μg/ml的PBS(pH7.6)适量，冰水中匀浆，20000g4℃离心15min，移取上清液分装备用。IL-10含量的ELISA测定按试剂盒说明书操作。     各样品中IL-10的含量以每mg蛋白中所含IL-10的pg数来表示。蛋白含量系用UV-754型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)测定280nm、260nm的OD值，依下列公式计算而得：     蛋白浓度(mg/ml)=1.45×OD280nm—0.74×OD260nm? 1．6统计分析?     用t测验计算各组间细胞因子含量的差异显著性。胚胎吸收率和流产率用X2检验。? 2结果? 2.1LPS诱导孕鼠流产的效果?     试验A组，5只孕鼠有1只死胎已全部排出(注射LPS第2d便看到由阴道口排出死胎)，其余4只母鼠子宫内胎儿已全部死亡，并开始溶化，呈紫黑色，不易分辨个数。胚胎吸收率100%。B组小鼠注入PXF，5只孕鼠无一流产。多数胚胎存活，仅有少量死胎。胚胎吸收率为15%。C组小鼠灌服中药，再尾静脉注射LPS，6只孕鼠有2只发生流产。其中1只母鼠子宫内已无胎儿。其它母鼠子宫内偶见瘀血的死胎。胚胎吸收率35%。与B组相比，差异不显著。D组用PBS做对照，5只母鼠有4只流产。胚胎吸收率89%。E组于孕7d尾静脉注射PBS，5只母鼠均未流产。详见表1。 2.2IL-10的含量变化?     注射PBS的对照小鼠，子宫IL-10含量相对比较恒定，个体间差异不大。平均值为32.253±8.773pg/mg蛋白。静注LPS诱导流产小鼠(A组)，IL-10含量降至很低，为10.959±5.324pg/mg，约为正常值的1/3。B组小鼠事先注入PXF，再注射LPS，IL-10含量接近正常水平。说明用PXF阻断TNF-α的产生，能够阻止LPS的作用。C组小鼠预先灌服中药，IL-10含量水平与PXF处理组相接近。见表2。 （图表略） 3讨论?     Gendron等研究发现，妊娠早期鼠胚对LPS非常敏感。LPS对早期孕鼠似乎有部位特异性， LPS处理的小鼠，其它组织不表现任何病变［8］。LPS诱导流产机制是通过巨噬细胞（Mφ）释放TNF-α，TNF-α直接作用于胎盘血管，导致出血坏死。如TNF-α促使肉瘤组织出血坏死、萎缩消失便是通过这种类似机制［9］。在早产妇女的羊水中检出了LPS和TNF-α［10］。用人工重组TNF—α处理大鼠导致胎盘坏死［11］。Tangri等将胎盘细胞和淋巴细胞混合培养，发现与正常胎盘细胞相比，即将流产小鼠的胎盘能刺激淋巴细胞产生更多的TNF-α［12］。这些研究资料都表明，TNF-α可导致流产。LPS诱导小鼠胚胎吸收，子宫匀浆中TNF-α含量升高[13]。     用PXF预先给小鼠腹腔注射，阻止了LPS诱导的胚胎吸收，Th2细胞因子IL-10上升(表2)。PXF是一种TNF-α合成抑制剂，能够抑制预致敏的巨噬细胞中TNF-α mRNA的表达和TNF-α的合成[14]，降低LPS和TNF-α以及其它细胞因子对中性白细胞的活化作用［15］。Gendron等用PXF预先注射母鼠，再用LPS诱发流产，结果PXF阻止了子宫中TNF-α的升高(阻断90%)和胚胎吸收的发生［8］。Chaouat等也获得类似结果，并证明TNF-α和IFN-γ在诱导胎吸收方面有协同作用［16］。本试验中PXF阻断了LPS诱导流产的效果，说明LPS诱导流产与TNF-α有密切关系。?     IL-10属有益胚胎发育的细胞因子，在保护胎儿免受攻击方面起着至关重要的作用［1］。妊娠期间，IL-10进行性地下调IFN-γ。在母体蜕膜组织和/或胎盘中可合成IL-10［1,12］。Chaouat等的试验说明了Th2细胞因子IL—10对维持正常妊娠的保护作用：流产小鼠胎盘中IL-10含量低，IFN-γ、TNF-α含量高；非特异性免疫提高了小鼠胎盘IL-10含量和胚胎成活率；人工重组IL-10注射使母鼠胚胎吸收率显著降低，抗IL-10抗体提高了胚胎吸收率；给小鼠注入羊滋养层蛋白oTP，减少了胚胎吸收率，同时小鼠胎盘中IL-10水平上升［16］。Rivera等最近研究发现，低剂量LPS注射诱导鼠发生胚胎吸收，而注射外源性IL-10则显著降低了注射LPS所引起的胚胎吸收率［17］。在人类，用男性白细胞免疫复发性流产妇女，9人中有7人受孕，并正常分娩。测得IL-2和IFN-γ产生量降低，IL-10分泌量增多，同时NK、LAK细胞毒性明显下降［18］。妇女正常妊娠IL-10水平上升，IL-2和IFN-γ下降。病理妊娠时IL-10水平低下，而IL-2、IFN-γ水平较高［19］。这些研究资料都说明IL-10与正常妊娠的正相关关系。IL-10抑制Th1细胞和NK细胞产生TNF、IFN-γ，IL-1等［12］，可能是维持Th2反应和母体妊娠正常的重要途径。曾有报道认为，LPS诱导流产与IL-1有一定关系。用LPS注射使100%小鼠发生流产，事先注入IL-1受体抗体，则使胎儿死亡率由100%降至30%［20］。本试验中，LPS诱导小鼠胚胎吸收，子宫IL-10水平低于正常，用PXF或中药保胎，则使IL-10水平回升。说明了IL-10在维持正常妊娠中有重要作用。本研究直接测定了LPS诱导流产小鼠子宫胎盘组织中IL-10的含量，这一点未见前人报道。?     黄芩白术的安胎作用似乎适合于妊娠早期。《本草疏证》这样论述黄芩白术的安胎作用，“初妊之时，胎元未旺，吸血不多，则下焦血旺，气反上逆，是为恶阻。恶阻则中焦之气不变赤而为水，是白术在所必需矣。血盛能致气盛，气盛能生火，黄芩泄气分之火而不伤血者也。”此处“初妊之时”似指妊娠早期，而“血旺”“血盛”以致于“气盛生火”，可否理解成胚胎着床期的炎性反应阶段?黄芩白术配伍，寒温并用，补泻兼顾，似能调整妊娠初期的炎性反应。现代研究认为，黄芩伤害肥大细胞的酶激活系统，抑制过敏性介质的释放，抑制炎性反应和毛细血管通透性［21］。我们在前期研究中发现，子宫肥大细胞数量增多与胚胎丢失有密切关系。本试验结果观察到，流产的胎儿有出血瘀血现象，说明胎盘组织毛细血管通透性增大。使用黄芩白术预防组(C组)则胎儿生长正常，颜色粉红，没有瘀血现象。白术作为健脾补气药，可增加抗体生成，还可用于治疗风湿症。现代医学观点认为，类风湿性关节炎属于细胞介导的自身免疫病。妊娠时母体免疫系统以Th2反应(抗体介导的免疫)为主，细胞免疫功能受抑制，因而类风湿性关节炎症状减轻［4］。白术能够治疗风湿症说明可能对细胞介导的免疫有某种抑制作用。本试验结果表明，PXF和黄芩白术能够阻抑LPS诱发的流产，使子宫内IL-10水平上升，从而有利于正常妊娠。?