小檗碱、黄芩苷对小鼠2-细胞胚胎体外培养效果的初步研究

貔貅

摘要：试验以添加抗菌素的mCZB液为对照组，分别筛选比较了小檗碱、黄芩苷二种中药成分对小鼠2-细胞胚胎体外培养效果的影响。结果表明：小檗碱和黄芩苷(berberine and baicalin) 最佳浓度分别为0.10μg/ml和4μg/ml，其120h孵化胚胎发育率分别为89.9%和64.1%，与对照组比较差异极显著(50.7%) (P < 0.01)和显著(47.8%) (P < 0.05)。说明小檗碱、黄芩苷能有效促进2-细胞胚胎体外生长发育。
关键词：小檗碱，黄芩苷，2-细胞胚胎，体外培养，小鼠
中图分类号：S814.8文章标识码：A

Initial Study on Effect of Berberine and Baicalin on 2-cell

Embryos in vitroCulture in Mice
Abstract In this experiment，mCZB medium added in penicillin and dihydrostreptomycin was used as control group, the effect of the Chinese medicines component Berberine and Baicalin on 2-cell embryos in vitro culture from the mice were compared respectively. The results showed that the optimal level of Berberine and Baicalin were 0.10μg/ml and 4μg/ml, the development ratio of hatched blastocyst were 89.9% and 64.1% respectively at 120h, there weresignificantly difference (50.7%) (P < 0.01) and differently (47.8%) (P < 0.05) compared with control group.The results indicated that Berberine and Baicalin could accelerated development of 2-cell embryos in vitro.
Key words：berberine, baicalin , 2-cell embryos , in vitro culture , mice

    体外受精、胚胎分割、动物克隆、胚胎嵌合、胚胎干细胞、转基因动物等胚胎生物技术的应用，都需借助于胚胎体外培养系统。适宜的体外培养系统是获得优质胚胎的基础条件和有效工具。目前，体外培养的胚胎囊胚发育率较低，有相当比例的胚胎在培养过程中凋亡，严重影响了胚胎产业化进程，因此，探讨改进胚胎体外培养体系十分必要。
    体外培养的基本条件之一是无菌操作，为了防止因操作不严格而造成的污染，培养液内一般常常加入一定的抗菌素，最常用的是青霉素和链霉素，而抗菌素对体外胚胎的生长发育是否有不良影响，还有待探讨；体外培养条件下的胚胎，其代谢会产生一定的自由基，高氧浓度的自由基对胚胎产生毒性[1]，如过氧化氢、过氧化物阴离子、氢氧根离子等影响胚胎的正常卵裂和进一步发育。目前的研究表明，中草药中的某些有效成份对细胞的增殖有促进作用[2]，而且具有一定的抗氧化作用[3]和激素作用[4]等，而将中药成分添加到培养基中对胚胎进行体外培养国内外报道甚少。鉴于中药有效成分多靶点、全方位的药理作用特点，基于邸冉，高建明（2004)[5]将中药成分添加到培养基中对小鼠胚胎体外培养的初步研究结果，本试验以小鼠2-细胞胚胎为材料，在培养液中直接添加小檗碱、黄芩苷中药成分，比较其对胚胎体外发育的影响，并筛选其最佳浓度，旨在初步建立适宜胚胎体外发育的添加中药成份的培养体系，从而期望提高胚胎体外发育率和胚胎质量，为今后进一步克服胚胎体外培养系统存在的缺陷开辟一条新的途径。
材料与方法
1.1 试验动物
    试验小鼠为8～10周龄ICR系SPF性成熟小鼠(购自北京试验动物中心)。雌鼠体重29～32g，雄鼠体重33～35g，雌雄分笼饲养在室温、自然光照、自由饮水的条件下，采用全价繁殖颗粒饲料饲养。经一周的适应性饲养后，按常规方法对雌鼠进行超数排卵处理。
1.22-细胞胚胎获取
    根据小鼠阴部变化选择动情间期和动情前期雌性小鼠[6]于19:00腹腔注射PMSG（批号：20040403，天津试验动物中心）10IU/只，48h后腹腔注射hCG（批号：20031012，宁波市激素制药厂）10IU/只，注射hCG后即与公鼠按1:1合笼。次日8:00检查阴道栓，见阴栓者于注射hCG 47h后以颈部脱臼法处死雌鼠，取出输卵管和卵巢，置于37 oC mPBS冲卵液中，在体视显微镜下分离脂肪和系膜，用4号针头连接2 ml注射器撕开输卵管壶腹部获得2-细胞胚胎。选择形态正常、卵裂球均一、透明带完整的胚胎转入mCZB基础培养液洗涤3次，然后均匀分布到各试验组培养液中洗涤2次后入微滴进行培养。
1.3试验设计
    以mCZB为基础培养液。初步选出黄连有效成分小檗碱(Berberine，BR；天津药物研究院)、黄芩有效成分黄芩苷(Baicalin，Bai；天津药物研究院))作为添加的中药成分来筛选其对早期胚胎体外发育的影响。共设计2个试验，分别筛选其适宜浓度（表1）。

表1 试验组别设计

试验 设计	对照组		试验1组	试验2组	试验3组	试验4组	试验5组
	基础液	添加双抗
试验1	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+链霉素(0.07mg/ml)	mCZB +BR (0.08μg/ml)	mCZB +BR (0.09μg/ml)	mCZB +BR (0.10μg/ml)	mCZB +BR (0.11μg/ml)	mCZB +BR (0.12μg/ml)
试验2	mCZB	青霉素(0.06mg/ml)+链霉素(0.07mg/ml)	mCZB +Bai (2μg/ml)	mCZB +Bai (3μg/ml)	mCZB +Bai (4μg/ml)	mCZB +Bai (5μg/ml)	mCZB +Bai (6μg/ml)

1.4 胚胎培养
    在培养皿中按不同试验组别制备50ml的培养液小滴，覆以矿物油，置入5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的CO2培养箱中平衡2h以上。然后将已洗涤好的胚胎，用移卵管吸入到平衡好的培养小滴中，置入培养箱中培养。每个微滴中移入10枚左右的胚胎。入胚后15-h换加葡萄糖mCZB培养液，以后每间隔48h换液一次，分别于入培后48h、72h、96h、120h检查胚胎发育状况。

1.5小鼠胚胎发育时期判定
    本试验不同培养时间胚胎发育形态见表2。

表2胚胎形态学判定[7]

发育时期	形态特征
桑椹胚(M)	卵裂球隐约可见，细胞团的的体积几乎占满卵周隙.
致密桑椹(CM)	卵裂球在桑椹的基础上进一步分裂变小，看不清楚卵裂球的界线，细胞团收缩至卵周间隙的60%～70%。
早期囊胚(EB)	出现透明的囊胚腔，但难以区分清内细胞团和滋养层，细胞团占卵周间隙的70%～80%。
囊胚(B)	囊胚腔增大明显，内细胞团和滋养层细胞界线清晰，细胞充满了卵周间隙。
扩张囊胚(XB)	囊胚腔充分扩张，体积增至原来的1.2～1.5倍，透明带变薄，相当于厚度的1/3。
孵化囊胚(HB)	透明带破裂，内细胞团脱出透明带。

1.6 数据处理
    采用DPS专业版统计软件对数据进行卡方独立性检验。

2 结 果
2.1小檗碱对小鼠2-细胞胚胎体外培养效果的影响
    经8个批次，538枚胚胎的体外培养后，初步筛选出小檗碱5个浓度组，再进一步筛选其最佳浓度。观察对照组与试验组对胚胎体外生长发育的影响（见表3）。

表3小檗碱对小鼠2-细胞胚胎发育的影响

试验1	批次	入培胚胎数量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培数) M%	(B/入培数) B%	(XB/入培数)数)XB%	(HB/入培数) HB%
对照组	9	73	(73/73) 100a	(64/73) 87.6a	(53/73) 72.6a	(37/73) 50.7Aa
试验 1组	8	74	(72/74) 97.3a	(71/74) 95.9a	(67/74) 90.1b	(58/74) 78.3Bb
试验 2组	8	105	(104/105) 99.0a	(102/105) 97.1a	(99/105) 94.2b	(93/105) 88.6Bc
试验 3组	8	99	(97/99) 98.0a	(96/99) 97.0a	(96/99) 97.0b	(93/99) 89.9Bc
试验 4组	9	97	(95/97) 97.9a	(89/97) 91.8a	(85/97) 87.6b	(81/97) 83.5Bc
试验 5组	8	72	(67/72) 93.1a	(65/72) 90.2a	(62/72) 86.1b	(51/72) 70.8Bb

注：同一竖栏肩注不同大写字母之间表示差异极显著（P < 0.01），不同小写字母之间表示差异显著（P < 0.05），相同字母之间表示差异不显著（P > 0.05）。
    由表3可见，体外培养48h、72h，2-细胞胚胎发育至桑椹胚和囊胚发育率，对照组和试验各组间及试验组之间均无显著差异(P > 0.05)。体外培养96h，试验各组扩张囊胚发育率均显著好于对照组(72.6%) (P < 0.05)，各试验组间无显著差异(P > 0.05)，其中以试验3组发育率最高(97.0%)；试验各组120h孵化胚胎发育率极显著高于对照组（50.7%）(P < 0.01)，试验组间以试验2、3、4组孵化胚胎发育率显著高于试验1、5组(P < 0.05)，其中以试验3组发育率最好(89.9%)。

2.2黄芩苷对小鼠2-细胞胚胎体外培养效果的影响
    经5个批次，221枚胚胎的体外培养初步筛选后，选出黄芩苷5个浓度组再进一步筛选其最佳浓度。观察对照组与试验组对胚胎体外生长发育的影响（见表4）。

试验2	批次	入培胚胎数量/枚	48h	72h	96h	120h
			(M/入培数) M%	(B/入培数) B%	(XB/入培数) XB%	(HB/入培数) HB%
对照组	8	90	(85/90) 94.4a	(72/90) 80.0b	(64/90) 71.1b	(43/90) 47.8a
试验 1组	8	90	(81/90) 90.0a	(71/90) 78.9b	(55/90) 61.1b	(43/90) 47.8a
试验 2组	8	84	(71/84) 84.5a	(72/84) 85.7b	(55/84) 65.5b	(48/84) 57.1b
试验 3组	7	78	(72/78) 92.3a	(66/78) 84.6b	(62/78) 79.5b	(50/78) 64.1b
试验 4组	8	89	(88/89) 98.9a	(77/89) 86.5b	(67/89) 75.3b	(51/89) 57.3b
试验 5组	6	70	(61/70) 87.1a	(57/70) 81.4b	(49/70) 70.0b	(32/70) 45.7a

表4黄芩苷对小鼠2-细胞胚胎发育的影响

注：同一竖栏肩注不同大写字母之间表示差异极显著（P < 0.01），不同小写字母之间表示差异显著（P < 0.05），相同字母之间表示差异不显著（P > 0.05）。

    由表4可见，体外培养2-细胞胚胎48h、72h、96h，对照组和各试验组及试验组间胚胎发育率均无显著差异(P > 0.05)；体外培养120h，试验2组(57.1%)、试验3组(64.1%)、试验4组(57.3%)孵化胚胎发育率显著高于对照组(47.8%)(P < 0.05)，试验组间以试验2、3、4组孵化胚胎发育率显著高于试验1、5组(P < 0.05)，其中试验3组孵化胚胎发育率最高(64.1%)。

3 讨 论
    本试验结果表明小檗碱和黄芩苷二种中药成分，以小檗碱对胚胎体外培养发育的效果最好。其体外培养的最佳浓度组和孵化胚胎发育率，小檗碱最佳浓度为0.10μg/ml，孵化胚胎发育率89.9%；黄芩苷最佳浓度为4μg/ml，孵化胚胎发育率64.1%。而二个试验中对照组孵化胚胎的发育率分别为50.7%、47.8%。对比试验结果可见，中药成分小檗碱和黄芩苷对胚胎体外生长发育发育起到了积极的促进作用。白照岱等(2004)[8-9]在CZB中添加不同浓度的胰岛素和葡萄糖，以及添加不同浓度的表皮生长因子对小鼠2-细胞胚胎体外培养孵化囊胚发育率分别为25.3%和21.2%。可见，本试验中药成分对胚胎发育的促进作用非常显著。
    小檗碱是黄连中的主要有效成分，是一种苯并异喹啉类季铵型生物碱。长期以来对其生化、药理、临床的研究，证明它是一种没有细胞毒和致突变作用、具有广泛用途的药物[10]。大量研究表明小檗碱具有广谱的体外抗菌效果，其低浓度可以抑菌，高浓度可以杀菌，另报道小檗碱抗痢疾杆菌作用强度与磺胺相近，但其作用不受血清的影响，另一方面小檗碱的抗药菌株产生较多，且无交叉感染[11]。黄芩苷的抗微生物的作用已早为医学界所认识，其清热解毒作用的实质就是对细菌和病毒等致病原的抑制或杀灭作用。本试验中，二种中药成分各试验组中均未添加抗菌素，可能与其抑菌作用有一定关系。
    CAMP和cGMP与细胞的增殖、分化和代谢密切相关。cAMP有促进细胞分化的作用，cGMP则具有促进细胞分裂的作用。Manejwala等(1986)[12]研究证明用cAMP类似物培养早期胚胎,能促进囊胚腔的扩张。Hui等(1991)[13]在人血小板体外试验证明小檗碱可使cAMP升高，亦可抑制其升高，视不同条件而定。推测小檗碱可能对胚胎cAMP和cGMP有积极的作用。生理水平的NO作为信号分子可以对早期胚胎发育产生调节作用也需要通过cGMP实现[14-15]，而NO是一种自由基性质的气体，分子量小，化学结构简单，由于其含有一个未成对电子，故有很大的生物活性，它可以自由穿过生物膜，作用于细胞内的靶分子，作为第二信使而发挥信息传递的功能，并以相对特异的方式控制多种细胞的功能或生理作用，在受到各种刺激因素，如外来抗原、细菌内毒素、或细胞因子等诱导活化时，诱导NOS（iNOS）可生成大量的有持续活性的NO，参与免疫系统的非特异性防御功能。NO在免疫与炎症反应中的细胞毒作用也可损伤正常的组织，导致NO的保护与损伤双重作用[16-17]。NO生成过多且时间过长，可能导致多种病理改变，反之，若NO合成不足又会使NO的生理功能得不到正常的发挥，所以说NO具有两面性，是“双刃刀”。Ko等(2000)[18]通过离体大鼠肠系膜动脉研究报道，小檗碱是通过作用于血管内皮和平滑肌细胞两种途径而产生血管松驰作用的。血管内皮释放NO是小檗碱产生血管松弛作用的内皮依赖性机制，说明小檗碱与细胞分泌NO的作用相关。本试验中，小檗碱极显著的促进了胚胎的生长发育，是否与直接或间接对胚胎发育的微环境起到调节作用还有待进一步研究。
    胚胎代谢所产生的自由基，如过氧化氢、过氧化物阴离子及氢氧根离子等影响胚胎的正常卵裂。囊胚对过氧化脂质导致的损伤十分敏感[19]。正常小鼠卵母细胞中的H2O2水平较低，1-至8-细胞期的H2O2水平略高于以后各期胚胎的水平。但当在体外培养1-细胞或2-细胞胚胎时，到2-细胞中期时的H2O2水平已经很高，而且一直到整个4-细胞期均居高不下[20]，这种水平的H2O2水平恰好发生在胚胎基因的激活时期。而黄芩苷在清除自由基作用效果明显。有研究表明黄芩苷对羟自由基、超氧阴离子自由基、烷过氧自由基等有较强的清除作用；对过氧化脂质生成的抑制作用也很明显[21-23]。这可能是本试验中添加黄芩苷最佳浓度组结果优于对照组的原因。
    小檗碱、黄芩苷对2-胚胎细胞发育的促进作用通过本试验可以明显看出是客观存在的，其作用机理还有待今后进一步的研究探讨。