双连翘粉针的质量标准研究

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双连翘粉针的质量标准研究 张国红  王刚  杜国清 （四川华西动物药品研究所，绵阳高新区，　621000　） 汪勇熊剑于飞 （四川华西动物药业集团有限公司，绵阳高新区，621000）

摘要　目的：用反相高效液相色谱法测定连翘生药及双连翘粉针等含连翘制剂中连翘苷的含量。方法：样品用氧化铝柱净化后在ODS柱上分析，流动相为乙腈-水(22∶78)，紫外检测波长为230 nm。结果：该方法的线性范围为0.15～1.95 μg，回收率为101.3%，RSD为1.3%。结论：该方法能消除中药制剂中复杂组分的干扰，准确地对连翘苷进行含量测定。 关键词：连翘苷；高效液相色谱法；双连翘粉针     双连翘粉针是由连翘、双花和板蓝根三味中药的全提取物经科学方法精制而成，是治疗传染性胸膜肺炎、肺疫、喘气病、葡萄球菌病、链球菌病、大肠杆菌病、痢疾杆菌病、肺炎球菌病、绿脓杆菌病、脑膜炎双球菌病、结核病、乳房炎、子宫炎等细菌性疾病和流行性腹泻、流感、圆环病毒病、蓝耳病等病毒性疾病的中药注射制剂[1,2]。具有抗菌抗病毒、利胆保肝、止咳平喘、调节免疫等作用[3]。其主药连翘具有清热止呕、清利肝胆、除湿退黄、通调三焦等多种作用[4]。连翘中的主要生物活性成分连翘苷具有较强的抗菌作用，并能抑制CAMP磷酸二酯酶的活性[5]，故以连翘苷作为指标成分，进行了含量测定。 　　以往文献报道对连翘苷的测定方法有薄层色谱法[6]、梯度洗脱的RP-HPLC法[7]等。钟品以硅胶G-4%NaAc薄层板鉴别连翘时，供试品溶液在与连翘对照药材色谱相应位置上显2个颜色相同的斑点;而阴性对照液不显相应主斑点[8]。张玲等采用双波长薄层扫描法测定青翘和老翘中连翘苷的含量，青翘中连翘苷含量为0.076%；老翘中仅为0.012%。作者认为双波长薄层展开及显色系统测定连翘苷，方法简便、快速、灵敏度高、重现性好，可作为连翘药材及含连翘制剂的质控方法。在连翘苷提取分离中，采用氯仿进行提取，再用水洗去氯仿提取液中水溶性杂质，可有效地去除干扰，薄层效果较好[9]。中药制剂中连翘苷的测定未曾报道过。王雪等用反相高效液相色谱法测定连翘生药及银甲妇康液等含连翘制剂中连翘苷的含量。线性范围为0.15～1.95 μg，方法回收率为101.3%，RSD为1.3%。作者认为该方法能消除中药制剂中复杂组分的干扰，准确地对连翘苷进行含量测定[10]。我们用氧化铝柱层析对样品进行净化处理后，采用ODS柱、乙腈-水(22∶78)为流动相的RP-HPLC法，能够准确地对双连翘粉针中的连翘苷含量进行测定，阴性对照不干扰，取得较为满意的结果。 1　仪器与试药 　　日本岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器，C-R4A数据处理机。连翘苷对照品(中国药品生物制品检定所)，双连翘粉针(四川华西动物药业有限公司)。乙腈(色谱用)，重蒸馏水。 2　实验方法 2.1　供试品溶液的制备 2.1.1双连翘粉针　精密称取双连翘粉针0.5g，加甲醇10 mL，充分搅拌后过氧化铝柱(17 cm×2 cm，中性氧化铝20 g)，用50%的甲醇35 mL少量多次洗脱，收集洗脱液于水浴上挥干，残渣用50%的甲醇溶解后转移至25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，过滤，弃去初滤液，收集续滤液备用。 2.1.2双连翘粉针阴性对照　去掉处方中的连翘全提取物后，照生产工艺制备得到双连翘空白粉针（由四川华西动物药业有限公司提供），然后按“2.1.1”项的方法制备得到阴性对照液。 2.1.3连翘　取适量连翘生药粉碎后，精密称取生药粉末0.5 g，加甲醇15 mL超声提取30 min后，转移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。 2.2　连翘苷对照品溶液的配制　精密称取连翘苷对照品25 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度约为0.50 mg。mL-1的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液15 mL于50 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀释到刻度，摇匀，即得浓度约为0.15mg。mL-1的对照品溶液。 2.3　色谱条件　经试验后选定的色谱条件为色谱柱:Shim-Pack CLC ODS柱(150 mm×6.0 mm)，柱温:30℃;流动相:乙腈-水(22∶78)，流速:1.0 mL。min-1;检测波长为230 nm。 3　实验结果 3.1　色谱图　在选定条件下，连翘苷对照品、银甲妇康液、连翘以及双连翘粉针连翘阴性对照的色谱图见图1。可见，连翘苷出峰处阴性对照无干扰。 图1　连翘苷和双连翘粉针的色谱图     a.连翘苷对照品　b.连翘苷阴性对照c. 双连翘粉针　d.连翘药材     1.连翘苷(23.06 min) 3.2　线性与范围　分别取连翘苷对照品溶液1，3，5，7，9，11，13 μL进样，样品平行操作，记录色谱图，以峰面积对连翘苷的进样量X(μg)作线性回归，得到线性方程为:A=8.446+759.6 Xr=0.9996。说明连翘苷进样量在0.15～1.95 μg范围内线性较好。 3.3　回收试验 3.3.1净化回收率　分别精密量取连翘苷对照品溶液2 mL，分别加水2 mL，照双连翘粉针样品预处理方法制备试验溶液。另精密量取同一对照品贮备液2 mL，置25 mL容量瓶中，用50%的甲醇稀释到刻度，即得对照溶液。供试溶液和对照溶液分别进样10 μL，记录色谱图，根据所得峰面积，计算净化回收率。平均净化回收率为99.1%(n=6)，RSD=0.74%。说明采用选定方法净化样品有很好的净化回收率。 3.3.2加样回收率　取双连翘粉针空白溶液(双连翘粉针的处方中去掉连翘，但制备工艺相同)25 mL，分别准确加入一定量的连翘苷对照品，照双连翘粉针样品预处理方法制备得试验溶液。进样10 μL，另取连翘苷对照溶液1，3，5，7，9，11，13 μL进样，按标准曲线法测定并计算加样回收率，结果见表1。平均回收率为101.3%，RSD=1.3%，n=15。 表1　回收率测定结果(n=3) 加入量/mg 回收率/% RSD／% 0.492 102.3 1.15 0.98 100.6 1.62 1.48 100.8 1.25 1.97 100.3 0.76 2.46 102.3 0.23 3.4　重复性试验　分别精密量取同一供试品溶液25 mL，照预处理项下供试品溶液制备方法制备试验溶液，取10 μL进样，测得平均峰面积值为A=552 180，RSD为0.54%(n=6)。 3.5　稳定性试验　于0，2，4，6，8，12 h取同一供试品溶液和对照品溶液各10 μL，分别进样2次，计算日内RSD分别为1.11%和0.91%。再于第1，2，3，4 d分别取同一供试品溶液和对照品溶液各10 μL，进样2次，计算日间RSD分别为2.54%和0.84%。 3.6　进样精密度试验　取对照品溶液，重复进样6次，根据峰面积值，计算得平均峰面积A=737880，RSD为0.85%。 3.7　系统适用性试验　照“2.1.1”项下方法制备样品溶液，照“2.3”项下的色谱条件进样1次，以连翘苷峰计算，测得柱效为9.2×103，连翘苷与其前后杂质的分离度分别为8.85和5.31。 3.8　样品测定　采用前述的样品预处理方法和色谱条件，分别测定了5个批号的双连翘粉针中连翘苷的含量以及连翘生药中连翘苷含量，结果见表2。 表2　不同样品中连翘苷的含量(n=3) 样品 平均含量/mg。mL-1 RSD/% 双连翘粉针20040315 0.584 1.11 20040326 0.512 0.15 20040407 0.757 1.19 20040428 0.892 0.42 20040509 0.255 0.61 连翘 0.0120(mg。mg-1) 1.35 4讨论 4.1我们曾经采用过甲醇(含1%的四氢呋喃)-水(含0.01 mol。L-1磷酸二氢钠，pH 3.2)(40∶60)的系统，不同比例的乙腈-甲醇-水系统，以及不同比例的乙腈-水系统，结果表明：乙腈-水为22∶78时，连翘苷峰形对称，分离完全，阴性对照不干扰。我们同时还发现，乙腈比例微小的变化会较显著地影响连翘苷的保留时间。 4.2在样品预处理方法中，我们曾尝试采用过液液萃取法和硅胶柱作为层析柱的方法。前者由于净化不完全，引入杂质多而放弃。后者则会使连翘苷在柱上的保留性较强，不易被完全洗脱。采用中性氧化铝柱，连翘苷能很容易地被50%甲醇洗脱，而中药制剂中黄酮类等干扰组分能够有效地被保留在柱上，用于以上几个品种的预处理，净化效果好，故确定采用氧化铝柱。 4.3在对不同批号的双连翘粉针中连翘苷测定时，发现其含量差异较大。

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现在拿到国标没有？？？