生物牛黄中间体抗病毒作用及对家兔血液流变学指标的影响

貔貅

付本懂1，张继东2，钟秀会1，李淑芳2，杨淑亚3，苑方重1 （1. 河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2. 湛江海洋大学，动物科学系，广东. 湛江.524005；3.河北省畜牧兽医研究所，河北.保定.071000）

摘要：本文运用比较药理学方法将生物牛黄中间体与天然牛黄、人工牛黄在抗病毒及血液流变学方面进行了药效学比较研究。结果显示，生物牛黄中间体25、50、100mg/kg体重及人工牛黄50mg/kg体重灌胃给药的大鼠含药血清，经灭活，在10倍稀释的情况下，在鸡胚成纤维细胞上使新城疫Ⅰ系疫苗毒的TCID50升高1个滴度；生理盐水组、天然牛黄50mg/kg体重剂量组10倍稀释大鼠含药血清，灭活后，在鸡胚成纤维细胞上使新城疫Ⅰ系疫苗毒的TCID50降低1.5个滴度。生物牛黄中间体25、50、100mg/kg体重剂量灌胃给药，可以明显地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和红细胞聚集指数；天然牛黄50mg/kg体重剂量组对血沉值和血沉方程K值具有显著降低作用；人工牛黄50mg/kg体重剂量组对血沉值具有显著降低作用。 关键词：生物牛黄中间体；天然牛黄；人工牛黄；抗病毒作用；血液流变学 牛黄是一种常用的名贵中药，味苦、甘，性凉。归心、肝经。具有清心解毒、凉肝息风、豁痰开窍等功效。因天然牛黄药源紧缺，人们一直进行着牛黄代用品的研究，如人工牛黄、培植牛黄等。但这些代用品与天然牛黄相比都有其一定的局限性。本试验运用比较药理学方法对生物牛黄中间体与天然牛黄、人工牛黄在抗病毒及血液流变学方面进行了药效学比较研究，旨在为生物牛黄中间体进一步应用于临床实践，提供药效学基础数据和理论依据。 1 材料与方法 1.1　试验材料 1.1.1　试验动物 SD大鼠：清洁级，200～250g，雌雄兼用，购自河北医科大学实验动物中心； 大耳白兔：健康，1.5kg左右，雌雄兼用，购自保定市某养兔场； 9日龄鸡胚：新城疫病毒、法氏囊病毒、马立克病毒检查阴性，由瑞普(保定)生物药业有限公司惠赠。 1.1.2?病毒 新城疫Ⅰ系疫苗毒株，由瑞普(保定)生物药业有限公司惠赠。 1.1.3?主要试剂 生物牛黄中间体：河北省畜牧兽医研究所动物临床医学研究中心制备，红黄色粉末，味苦； 天然牛黄：购自河北省安国市药材市场； 人工牛黄：购自河北省安国市药材市场； 胰蛋白酶(1:250)：Difco公司生产,0152-17 ； RPMI Medium 1640：GIBCO公司生产,Lot NO.1120708； 胎牛血清(无支原体)：三利生物制品厂生产,20021002 。 1.1.4　主要器材 VISCOMETER R80 autowash STEELLEX：北京中勤世帝科学仪器有限公司； Sysmex CA-500 SERIES：北京威士达医疗有限公司； 96孔细胞培养板：美国 Costar公司生产。 1.2 试验方法 1.2.1　生物牛黄中间体的抗病毒作用 1.2.1.1　大鼠含药血清的制备 选择日龄相同，体重接近的SD大鼠，雌雄兼用，随机分为6组，每组5只，即生理盐水组（1ml/kg体重），天然牛黄组（50mg/kg体重），人工牛黄组（50mg/kg体重），生物牛黄Ⅰ组（25mg/kg体重）,生物牛黄Ⅱ组（50mg/kg体重），生物牛黄Ⅲ组（100mg/kg）。每天灌胃2次，连续给药3d，最后一次给药后1~2h内，无菌采血，采血后置4℃冰箱内过夜。3000rpm，离心15min，取血清，加入双抗，置4℃冰箱内保存。加入96孔培养板前大鼠含药血清在56℃，30min条件下，进行灭活。 1.2.1.2　半数细胞培养物感染试验（TCID50） 参照殷震(1997)[1]试验方法，将新城疫Ⅰ系疫苗毒用Hanks液10倍递增稀释成10-4~10-12，取96孔细胞培养板上培养24h的单层鸡胚成纤维细胞，每个稀释度接种8孔，每孔20μl。同时设空白对照孔。37℃吸附1h，加入用维持液稀释10倍的大鼠含药血清200μl，于37℃，5%CO2环境中培养，逐日观察细胞病变（CPE）情况至第7d，记录接种病毒后细胞病变情况，按Reed-Muench二氏法求病毒对鸡胚成纤维细胞的TCID50。 1.2.2　生物牛黄中间体对家兔血液流变学指标的影响 1.2.2.1　试验组的设定 健康大耳白兔，体重1.5kg左右，雌雄兼用，随机分为7组，每组5只，即空白对照组、生理盐水组（5ml/kg体重）、天然牛黄组（50mg/kg体重）、人工牛黄组（50mg/kg体重）、生物牛黄Ⅰ组（25mg/kg体重）、生物牛黄Ⅱ组（50mg/kg体重）、生物牛黄Ⅲ组（100mg/kg体重）。 除空白对照组外，其它各组每天灌胃给药1次，连续给药3d，于给药的第2d和第3d同时应用高分子右旋糖酐（10%高分子右旋糖酐，5ml/kg体重，参照文献[2]实验方法制备）耳静脉注射造模，每天耳静脉注射2次，于最后一次注射15min后，采血，注入含有抗凝剂的试管中，测定血液流变学指标。 1.2.2.2　血液流变学指标的测定 (1)血液粘度的测定：按VISCOMETER R80血液粘度仪操作手册测定。 (2)红细胞沉降率的测定：应用Westergren's 法。 (3)红细胞比容的测定：应用Wintrobe法。 (4)纤维蛋白原的测定：应用Clauss法，按Sysmex CA-500测定仪操作手册测定。 1.2.3　统计方法 所有数据均采用SPSS软件系统进行分析处理。 2结果 2.1　生物牛黄中间体抗病毒作用 病毒接种细胞后，于37℃，5% CO2环境中培养，逐日观察至第7d，记录细胞病变情况。各组测定的TCID50分别为：空白对照组，10.66/0.1ml；生理盐水组，9.15/0.1m；天然牛黄组，9.11/0.1m；人工牛黄组，11.45/0.1m；生物牛黄Ⅰ组，11.56/0.1m；生物牛黄Ⅱ组，11.42/0.1m；生物牛黄Ⅲ组，11.47/0.1m。 2.2　生物牛黄中间体对家兔血液流变学指标的影响 生物牛黄中间体对家兔血液流变学指标的影响见表1。试验结果表明，生物牛黄25、50、100mg/kg体重剂量灌胃给药，可以明显地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和红细胞聚集指数。天然牛黄50mg/kg体重剂量组对血沉值和血沉方程K值具有显著降低作用。人工牛黄50mg/kg体重剂量组对血沉值具有显著降低作用。与天然牛黄组、人工牛黄组比较，生物牛黄Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组对“血瘀”家兔的血沉值和血沉方程K值的抑制作用更加显著（P<0.01）。结果见表1。 表1 生物牛黄中间体对家兔血液流变学指标的影响 测定指标 组别 空白对照组 生理盐水组 天然牛黄组 人工牛黄组 生物牛黄Ⅰ组 生物牛黄Ⅱ组 生物牛黄Ⅲ组 全血粘度值（mPa?s） （切变率200 s－1） 2.62± 0.266 3.95± 0.474** 4.52± 0.304a 4.43± 0.409a 4.69± 0.338A 4.39± 0.208 4.07± 0.345 全血粘度值（mPa?s） （切变率30 s－1） 3.55± 0.339 5.02± 0.521** 5.73± 0.446a 5.59± 0.474a 5.78± 0.445A 5.49± 0.240 5.13± 0.378b 全血粘度值（mPa?s） （切变率 5 s－1） 6.30± 0.585 8.05± 0.764** 9.16± 0.874a 8.89± 0.644 8.84± 0.759 8.56± 0.369 8.15± 0.574b 全血粘度值（mPa?s） （切变率 1 s－1） 14.57± 1.454 16.68± 1.865 13.94± 6.763 18.21± 1.138 17.32± 1.705 17.18± 0.877 16.72± 1.520 血浆粘度值（mPa?s） （切变率 100 s－1） 1.40± 0.134 2.68± 0.217** 2.90± 0.185 2.83± 0.239 2.86± 0.144 3.13± 0.527a 2.79± 0.215 血沉（mm/h） 1.83± 0.408 152.5± 1.768** 133.5± 2.475a 136.0± 2.828a 49.75± 22.7ABC 106.33± 16.3ABC 75.00± 10.607ABC 红细胞压积（L/L） 0.34± 0.041 0.25± 0.033** 0.30± 0.008A 0.28± 0.019 0.29± 0.013a 0.27± 0.022 0.29± 0.041a 纤维蛋白原（g/L） 2.64± 0.527 2.74± 1.912 1.91± 0.781 1.50± 0.488 2.98± 0.603c 2.45± 1.478 2.16± 0.719 红细胞聚集指数 5.57± 0.477 4.26± 0.530** 4.18± 0.231 4.12± 0.196 3.69± 0.138abc 3.91± 0.190 4.13± 0.437 血沉方程K值 3.83± 0.983 207.5± 2.475** 270.5± 0.354A 245.0± 3.536 90.75± 40.9ABC 192.33± 43.848Bc 174.0± 43.134BC 注：（1）*，表示生理盐水组与空白对照组比较，差异显著(P<0.05)；**，表示生理盐水组与空白对照组比较，差异极显著(P<0.01)； （2）a，表示试验组与生理盐水组比较，差异显著(P<0.05)；A，表示试验组与生理盐水组比较，差异极显著(P<0.01)； （3）b，表示生物牛黄组与天然牛黄组比较，差异显著(P<0.05)；B，表示生物牛黄组与天然牛黄组比较，差异极显著(P<0.01)； （4）c,表示生物牛黄组与人工牛黄组比较，差异显著(P<0.05)；C，表示生物牛黄组与人工牛黄组比较，差异极显著(P<0.01)。 3讨论 3.1　生物牛黄中间体的抗病毒作用 据报道对于中草药的抗病毒作用，前人运用了多种方法进行研究，如运用中药提取液或提取成分，在鸡胚以及体外培养细胞上[3-6] 进行抗病毒试验。但是直接运用中药提取液或提取成分进行抗病毒试验不能很好地体现中药体内和体外效果的一致性。所以，近年来开始应用动物中药含药血清[7,8]进行中药药理学研究。为了探讨生物牛黄中间体的抗病毒作用，本试验采用大鼠的含药血清在鸡胚成纤维细胞上对新城疫Ⅰ系疫苗毒株的作用进行试验。结果表明，天然牛黄组与空白对照组比较，TCID50降低1.5个滴度左右，显示天然牛黄组大鼠10倍稀释血清，灭活后，对新城疫Ⅰ系疫苗毒株在鸡胚成纤维细胞上有一定的抑制作用。这种抑制作用可能与天然牛黄在体内的某种代谢成分与病毒进行互相作用有关。 本试验发现，生物牛黄Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和人工牛黄组与生理盐水组比较，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒在鸡胚成纤维细胞上的TCID50，说明生物牛黄Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和人工牛黄组的10倍稀释大鼠含药血清，灭活后，加大了新城疫Ⅰ系疫苗毒对鸡胚成纤维细胞的毒性。这是否与生物牛黄中间体和人工牛黄在大鼠体内某一具体代谢途径和代谢产物有关，还有待于进一步探讨。 3.2　生物牛黄中间体对家兔血液流变学指标的影响 血液流变学是研究血液固有的流动与变形特性的一门交叉学科，已经发现，血液流变学与心脑血管疾病、糖尿病等显著相关[9]。鉴于牛黄具有清心解毒、豁痰开窍等功效，其有可能通过影响机体的血液流变学指标来发挥药效。所以对生物牛黄中间体、天然牛黄和人工牛黄进行了血液流变学方面的研究。 红细胞聚集是红细胞之间的可逆性粘附。红细胞聚集性增强是体内血栓形成的危险因素之一,它可引起血流阻力增加,微循环淤滞,血流速度减慢,而血流速度减慢又有利于红细胞的聚集,从而构成恶性循环。右旋糖酐是常用的研究红细胞聚集的桥连物质。一般认为,高分子右旋糖酐是一种中性多糖类高分子化合物,它的一端附着在一个红细胞的表面,另一端附着在相邻的另一个红细胞表面,于是形成桥连,使红细胞相互叠连起来[10]。本试验中, 生物牛黄Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组可以明显地降低高分子右旋糖酐所致“血瘀”家兔的血沉值、血沉方程K值和红细胞聚集指数。天然牛黄组对血沉值和血沉方程K值具有显著降低作用。人工牛黄组对血沉值也具有显著降低作用。说明生物牛黄中间体、天然牛黄和人工牛黄可以抑制高分子右旋糖酐引起的红细胞的聚集。与天然牛黄、人工牛黄相比，生物牛黄中间体作用更加显著。其机制一方面可能是它们作为一个大分子占据红细胞表面大分子结合位点,与桥连大分子竞争结合,或者是通过作为一种空间障碍而阻碍了大分子桥联来实现的，另一方面也可能与它们能够保护红细胞膜本身有关。故通过影响机体的血液流变学指标，有可能是牛黄发挥药效的途径之一。