准确测定和表征β-葡聚糖酶活的方法与比较

jancie_wuhan

准确测定和表征β-葡聚糖酶活的方法与比较
1. β-葡聚糖酶的应用及作用机理
β-葡聚糖作为植物细胞壁的结构性非淀粉多糖，广泛存在于燕麦、大麦、黑麦、小麦等麦类作物中。如图1 所示，常见麦类作物中，燕麦和大麦β-葡聚糖含量较高，其中燕麦含量最高(Choct M andAnnison G.,1990)。在饲料、啤酒等行业中，由于β-葡聚糖是限制麦类有效利用的主要因素，常使用β-葡聚糖酶来有效分解麦类植物胚乳细胞壁中的β－葡聚糖，以降低饲料中非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide,NSP）及其抗营养因子的含量；降低啤酒酿造中麦汁黏度，提高麦芽溶出率，稳定啤酒质量。

图1 常见麦类作物中β-葡聚糖含量
   
β-葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的专一性内切酶。图2示出β-葡聚糖的基本结构以及酶切作用的机理。其中，每个实心圆表示一个葡萄糖分子，实心圆之间连线表示糖苷键，箭头所示为酶切位点。从图中可以看到，葡萄糖分子之间通过β-(1→4)糖苷键形成结构单体(monomer)：包括纤维三糖(cello-trisaccharide)、纤维四糖(cello-tetrasaccharide)和极少量的低聚糖(cello-oligosaccharide)，同时结构单体之间通过β-(1→3)糖苷键连接从而形成β-葡聚糖线性结构。当β-葡聚糖酶作用于β-葡聚糖的β-(1→3)、β- (1→4)糖苷键时，可使糖苷键断裂，将其降解成寡糖和单糖。

图2 β-葡聚糖分子结构图和酶切位点示意图

2. 测定β-葡聚糖酶活性的标准方法
  β－葡聚糖酶活的测定方法主要有3种，即还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。其中还原糖测定法（分光光度法）简便实用，比较准确，而且测定的结果重复性好，对于β－葡聚糖酶活的测定，一般认为是其3种方法中的首选方法；粘度测定法虽然更接近酶和底物在动物体内的作用方式，但这种方法目前仅能进行半定量描述，而且测定时比较繁琐费时；底物染色法是一种新型的方法，它是通过对底物的人工着色，然后测定颜色的变化来计算酶活，但这种方法难以操作，目前还没有得到广泛应用（王在贵等，2002）。
   目前国内外采用较多的还是还原糖测定法（分光光度法），其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。由于反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β－葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以通过分光比色测定反应液颜色的强度，从而计算反应液中β－葡聚糖酶的活力（农业部标准，NY/T 911-2004）。
3. β-葡聚糖底物的选择对β-葡聚糖酶活测定的影响
虽然各类作物中β－葡聚糖的含量不同，但分子结构都是相似的，即葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)键相连的线性聚合物，不同点仅仅在于主要结构单体的纤维三糖和纤维四糖的比例不同，即β-(1→3)和β-(1→4)两种糖苷键的比例不同 (Susan M et al.,2004)。那么，选用不同作物来源的β-葡聚糖作底物对酶活测定有没有影响呢？
从酶的作用机理来看，β-葡聚糖酶的酶切作用只对糖苷键的键型有选择性，即专一性针对β-(1→3)和β-(1→4)键，而对糖苷键的比例没有选择性。
另外，根据β－葡聚糖酶活单位的国际定义：在pH5.0、40℃条件下，每分钟从β－葡聚糖底物溶液中降解释放1μmol还原糖（表示为还原糖当量）所需要的酶量为一个酶活单位，简称为U，我们可以看到，国际定义中是通过测定由酶分解底物产生小分子还原糖的量还原糖当量来计算样品酶活的。因此，不管这种β-葡聚糖来源于哪一种麦类作物，只要底物越纯、低聚合度小分子糖类含量越少，即能准确的表征β-葡聚糖酶活（王在贵等，2002）。
4. 百特纯（Putus Macromolecular Sci & Tech Ltd.）生产的β-葡聚糖的特点以及在酶活测定的应用。
有些科研单位和生产企业为了节省经费，采用自制的β－Glucan（大麦提取）作底物，虽然效果也还好，但不宜作为最终产品的验证试剂。目前国内外能提供β-葡聚糖纯品的公司较少，仅有的几种产品售价偏高，例如Sigma、Merck公司的大麦β-葡聚糖平均售价在3500-4000元/g左右，无疑增加了β-葡聚糖酶产品成本，限制了其广泛应用。
百特纯大分子科技有限公司（Putus Macromolecular Sci.&Tech..Ltd）是主要从事碳水化合物大分子领域新品研发及应用的国际公司，制造并提供高质量、高纯度、高均一性的具有特定分子量和支化度的碳水化合物大分子标准品及其相关产品。公司采用β-葡聚糖含量最高的燕麦作为原料，提供的燕麦β-葡聚糖纯品（PS-OBG）纯度高达97%以上，并且拥有高、中、低三种不同规格分子量，不含淀粉、蛋白质等杂质，水溶性好，稳定性高，是作为β-葡聚糖酶活测定的良好底物，而且价格在市场上具有较强的竞争优势。
百特纯大分子（武汉）科技有限公司
技术部：王芙蓉
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Email:putusstandard@gmail.com
参考文献：
1、Choct M., Annison G. Anti-nutritive activity of wheat pentosans inbroiler diets [J]. British Poultry Science, 1990, 31:811-822.
2、SusanM., Yolanda B., Peter J., Wang Q., John W. Evaluation of Structure inthe formation of gels by structurally diverse (1→3)(1→4)-β-D-glucansfrom four cereal and one lichen species[J]. Carbohydrate Polymers,2004, 57:249-259
3、王在贵,何瑞国,张宏福.饲用β－葡聚糖酶活力测定需注意的几个问题[J].饲料广角, 2002,(08)
4、农业部标准：农业部2006105172955906, «饲料添加剂», β一葡聚糖酶活力的测定, 分光光度法, Determinationof β-glucanase activity in feed additives —Spetrothoetric method,2005-01-04 发布, 2005-02-01 实施

[ 本帖最后由 jancie_wuhan 于 2007-10-30 17:00 编辑 ]

southmigrant

Sigma不是有一种Dextran的葡聚糖吗？也还比较便宜，能作为底物吗？

jancie_wuhan

你说的Dextran跟β－葡聚糖的结构是不同的，它是一种葡萄糖以α（1-6）为主链，α（1-3）或α（1-4）、α（1-2）为支链相连接的多聚糖，而β－葡聚糖是葡萄糖以β-(1→3)和β-(1→4)键相连的线性聚合物。由于β－葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的专一性内切酶，所以在测定酶活时，底物应该选择相应的β－葡聚糖。