猪伪狂犬病诊断方法研究进展

kinki0396 · 发表于 2007-7-13 10:36:41

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，最早发现于美国，因临床表现与狂犬病类似，故称伪狂犬病。该病在全球范围内的流行呈上升趋势，世界上已有50多个国家和地区报导该病的流行。我国自1947年刘永纯从猪体分离到PRV以来，已有24个省(市)、自治区报导流行[1]。文章主要对血清学、分子生物学诊断与检测方法以及鉴别诊断方法进行综述。

1　传统诊断方法

1.1　临床诊断和病理组织学检查

成年猪无明显症状，母猪流产或产死胎，仔猪表现神经症状，肌肉振颤，严重时四肢划水样运动，体温升高达41 ℃～42 ℃。取PR病例的脑和脊髓做成组织切片，苏木素-伊红染色后观察呈现非化脓性脑炎变化，其他大体剖检特征不明显。在神经细胞、胶质细胞和毛细血管内皮细胞可检出A型核内包涵体。

1.2　动物接种试验

将典型病例病料悬液给家兔、小鼠或鸡胚接种，观察其临床症状的出现从而确诊。家兔出现精神委顿，体温升高，继而注射部位出现奇痒症状，随即肌肉痉挛，角弓反张，最后死亡。小鼠接种后有奇痒症状，持续12 h，在2 d～5 d内死亡。鸡胚接种后3 d～4 d后，病毒侵害神经系统，鸡胚死亡[2]。

2　血清学诊断

2.1　中和试验

中和试验(serum neutralization test，SN)又称微量血清中和试验(mircoserum neutralization test，MSNT)，作为病毒检测的经典方法，是世界上多数国家检测PR的法定方法之一[3]。

方六荣等[4]用MSNT进行了PR的血清学调查。通过监测中和指数和中和效价，发现SNT的特异性很强，但敏感性较低。如果延长抗原与血清的孵育时间，尤以补体存在时，可使其敏感性增高。由于该法操作繁琐，工作量大，且受技术、细胞等条件限制，给实际应用带来一定的困难。

2.2　乳胶凝集试验

乳胶凝集试验(latex agglutination test，LAT)利用抗原抗体特异性结合的性质，先用乳胶包被抗原，再与相应血清反应，如几分钟内发生凝集，可判定有PRV感染。日本的柴因勋对比了LAT和SNT，检验了1 659份血清样品，发现LAT和SNT的相符程度达97.6%。且由于LAT可以检测有很强凝集活性的IgM，可以早于SNT检测到PR病毒的抗体。国内吴斌等(1997)做了同类试验也表明LAT和SNT间无统计上的差异。美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用[5]，华中农大也于国内率先研制成功LAT试剂盒。LAT操作简单、方便、快速，且敏感性、特异性强，适用于疫病监测或流行病学调查，以及种猪群检疫净化阳性猪初次筛选。与SNT相比，LAT具有更加广阔的推广前景[6]。

2.3　免疫荧光试验

Stewart等(1967)首先应用荧光抗体染色法(immunofluorescence，IF)检查分别以病毒和病料接种的PK-15细胞培养物，获良好结果。用免疫荧光技术对采自不同组织的病料进行检测发现，扁桃体和淋巴结的检出率最高，其次是大脑、脾和脊髓。黄骏明等(1995)报导建立了检出率在95%以上的直接免疫荧光试验。取病猪的脑三叉神经、延脑和脊髓等组织作冰冻切片后免疫荧光检查，可于2 h～ 4 h内得到结果。此法是我国目前用于PR快速诊断的一种较好的方法。

2.4　酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-Iinked immunosorbent assay，ELISA) 具有快速、简便的优点，IgM-ELISA还可早期检测[7]。OIE将其作为诊断猪PR的首选血清学方法。美国也将ELISA作为3种PR的法定检测方法之一。

用ELISA检测PRV抗体的方法由Snyder等(1978)首创。Homme P等 (1997)将PRV gD基因在杆状病毒中表达，制成重组抗原并建立了竞争ELISA(cELISA)。用此法可检测到感染2周后血清阳转的情况。Gut M等[8]用同样载体表达了gE糖蛋白和gI糖蛋白，构建了直接竞争ELISA(gE/gI -ELISA)，试验证明gE/gI ELISA比gE-ELISA的敏感性和特异性更强，还可用于检测感染2周龄的早期感染猪血清中的抗体。

娄高明等(1998)建立了检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA法，因其操作简便，不需要昂贵的仪器，因此适合大规模的检验检疫。四川农业大学的曹三杰等[9]建立了Dot-PPA-ELISA，可检测最低IgG含量为1.398×10－8g。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的Dot-ELISA试剂盒已投入使用[10]。

2.5　琼脂扩散试验

1977年Gutekunst D E等首次报道了利用微量免疫扩散试验(microimmunodiffusion test，MIDT)检测了2 200多头猪血清中的PRV抗体，其阳性结果与SNT相同[11]。此法所得结果不受血清污染、溶血和细胞毒素等条件的影响，具备经济和操作简便、重复性好、特异的优点，但敏感性不高。Willam P(1994)分别对MIDT、SNT、对流免疫电泳(countercurrent immunoelectrophoresis，CIE)进行了比较，3种方法的检测结果也很接近。国内的黄生(1989)、吴斌(1997)在做了同类的比较试验后认为MIDT操作简单，结果准确，适合基层和大型猪场使用。

2.6　血凝试验与血凝抑制试验

Tetsu N等(1989)发现PRV可以凝集Balb/c小鼠红细胞，并以此建立了PRV的血凝试验与血凝抑制试验(hemagglutination or HA-inhibition，HA或HI)，检查猪血清抗体的结果与SNT紧密相关，但是HI效价较低。Inaba Y将抗原与血清孵育时间延至48 h，再加补体继续孵育1 h，效价比前法高2倍～32倍。但是，Yamada S等研究发现gC-PrV 突变株不能凝集红细胞。吴平等(1991)用单克隆抗体致敏绵羊红细胞，建立了反向间接血凝抑制试验，SNT符合率为94%。

2.7　免疫组化法

Narita等(1982) 建立了免疫组化技术检测组织中重激活的PRV。Ducatelle等(1982)用免疫过氧化物酶技术检测了61头有神经症状的病猪，发现与病毒分离试验试验相符程度为95%。Afsher等(1986) 建立了可对PRV进行定量分析的免疫过氧化物酶蚀斑染色方法[12]。

除以上方法外，还有补体结合试验、皮肤变态反应试验、放射免疫试验[13]和对流免疫电泳等试验可用于PR的诊断。

3　分子生物学诊断

3.1　核酸探针技术

核酸探针又称核酸杂交(ribonucleotide hybridization)，具有高特异性、高敏感性的特点，已被用于PR的诊断。Brown T M等(1988)建立了检测感染猪体内PRV-DNA的原位杂交法[14]。Linne T(1987)报道的斑点杂交法中，用P32标记的探针在感染后4 h就可检出组织中的病毒DNA，而分离病毒需要1 d～2 d。Maes R K等[15]用生物素和地高辛标记探针，其敏感度为1 pg～5 pg。郭万柱 (1991)等也用全基因组和重组质粒制备了P32标记的探针，成功的检测了10 pg的PRV DNA。李学伍等(1997)利用PCR(polymerase chain reaction，PCR) 特异性扩增产物制备地辛高标记的探针，对闽A株、鄂A株、Baratna株、英国株及临床病料进行检测，结果与PCR检测结果相符，准确率为100%，灵敏度达到2 pg DNA。在没有PCR技术之前，核酸原位杂交技术是短时间检查PRV潜伏感染的最敏感的方法。

3.2　PCR诊断

Belak S等(1989)率先建立了PCR检测PRV的方法。Jestin A等(1990)由鼻拭子抽提核酸，扩增gD基因序列而检测到PRV。李学伍等(1998)研究发现，PCR的敏感性显著高于MSNT，PRV检出率最高的组织为三叉神经节(100%)。Galeota-wheeler等通过合成扩增gD基因的引物，从猪的扁佻体、三叉神经节、嗅球和脑干中检测出了潜伏感染的PRV DNA。Talmage T B等[16]应用来自gB(g)基因的寡核苷酸引物对活检的扁桃体细胞或实质组织进行扩增，可检查潜伏感染。其还通过应用来自gB 基因的嵌套引物对PRV DNA 进行扁桃体细胞内扩增并应用原位杂交来探查细胞内扩增的DNA，大大提高了检出率。Cheung A K[17]也通过PCR在14头猪中检出三叉神经节(100%)和扁桃体(86%)中的潜伏感染。PCR敏感性高，特异性好，费时少，可作为活体检查用。

4　鉴别诊断

目前，PR防控中使用了大量的疫苗，以上的检测方法无法区分疫苗毒和野毒的感染，要区分疫苗接种动物和野毒感染动物，就需要以下的鉴别诊断方法。

4.1　限制性核酸内切酶分析

Lomniczi B等(1984)对Bartha和Norden等疫苗毒株及Ka等野毒株DNA用BamHⅠ，Bgl和Kpn酶切分析，发现弱毒株在US区有缺失。Gielkens A L J等(1985)NIA-3等野毒株和Bartha，BUK，Ercegovac，B-KAL和MK-25 5个弱毒疫苗株DNA以BamHⅠ酶切分析也证实疫苗株在US区缺失，导致酶切图谱改变。此法可用于流行病学调查。

4.2　ELISA

根据疫苗株所缺失的糖蛋白可将鉴别ELISA分为gE-ELISA、gC-ELISA和gG-ELISA。其中gE-ELISA敏感性最高，应用较多，最早由荷兰的Van Oirschot J T等(1986)建立，其敏感性好于SNT。Morenkov O S等[18]建立了两种检测PR gE抗体的间接ELISA。一种是利用大肠埃希菌表达gE基因N末端氨基酸1位～125位的融合蛋白而建立的重组gE-ELISA，一种是利用亲和层析技术从病毒粒子中提纯的天然gE蛋白而建立的亲和层析gE-ELISA。这两种ELISA法均可区分gE基因缺失苗免疫与野毒感染所产生的抗体。美国和欧共体规定，使用的疫苗至少要缺失gE基因，利用gE-ELISA 就可将疫苗株和野毒株区分开，从而逐步根除PR。

此外，Cook等(1990)建立了检测抗gG 抗体的阻断gG-ELISA，该方法可以区分疫苗株与野毒株，但敏感性不如常规ELISA法[19]。有研究发现在有母源抗体存在的情况下，gG缺失株疫苗免疫原性好于gE缺失株。唐勇等也建立了gC-ELISA鉴别诊断方法，并成功的制成了试剂盒[20]。

ELISA方法敏感性高、特异性强，而且简便、快速、重复性好，适于大量样品的检测，是目前最好的鉴别诊断方法。但要注意根据不同地区或猪场所使用的基因缺失疫苗关联的ELISA法，以免造成误诊。

4.3　PCR

Scherba G等(1992)在根据gG基因和lacz基因设计了上下游引物，建立了区分PRV疫苗株与野毒株的PCR方法，并通过对PCR产物进行Southern杂交和液相色谱分析建立了定量PCR技术。Hasebe H等(1993)根据gD和gE-g I基因序列设计两对引物，对人工感染Bartha、BUK以及另外5株野毒的猪组织DNA进行扩增，也能有效地区分强弱毒。冉智光(1998)等分别根据gB和gE设计两对引物建立了复合PCR鉴别诊断方法，成功的将国内普遍防疫使用的Bartha-K61株和野毒株区分开。刘莉娜等[21]建立了多重PCR，检出了106 pg的基因缺失苗毒且特异性好。陈陆等[22]建立了gE/gB鉴别诊断方法，敏感、特异且可以检测潜伏感染。

5　电子显微镜检测

应用电子显微镜可以直接观察PRV粒子。王家富等(1996) 在电镜下观察纯化的PRV湖北株，发现结构与疱疹病毒极为相似，成熟的病毒颗粒呈球形或圆形，直径在200 nm，囊膜较厚，病毒外周可看到纤突，也可以看到直径约150 nm的小囊膜病毒、未成熟病毒粒子。

6　结语

目前，可以用来诊断猪PRV的多种检测手段中，传统检测手段可靠，但往往操作较复杂，或耗时较长，实际应用有一定困难。血清学检测手段，尤其是研制成功的LAT和部分ELISA试剂盒操作简单、方便，不需要使用昂贵复杂的仪器，已经被广泛应用，特别是鉴别ELISA试剂盒可鉴别野毒感染和疫苗免疫动物，但一些ELISA方法还不够完善仍，是有待解决的问题。分子生物学方法特别是PCR技术，随着研究的深入将更加趋于敏感、简便、快速、实用化。目前，美国和欧盟国家已经启动了PR扑灭计划。建立和完善可用于我国PR的控制以致最终消灭该病的诊断方法，是我国广大兽医科技工作者面临的重大课题之一。

www.zmyw.com转贴{点击查看}