（南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095） 在猪病中，猪瘟（Hog cholera，HC）是危害最大、最受重视的一种病。建国初期，何正礼、方时杰等选用抗原性优良的石门系毒株研究改进制成的猪瘟结晶紫疫苗效果明显，广泛应用后对控制当时猪瘟的流行曾起过一定作用。1956 年周泰冲、袁庆志等研制成功的中国系（C 系）猪瘟兔化弱毒疫苗，证明有高度安全性和优良的免疫原性，且无残毒，毒力不返强。自1 9 5 7 年起，除在我国广泛应用外，并已推广到欧亚很多国家，使这些国家控制或消灭了猪瘟。该疫苗被公认为目前世界上比较理想的猪瘟疫苗、这是我国兽医科学工作者的一大杰出贡献。 我国在猪瘟免疫程序、免疫诊断、免疫监测以及猪瘟病毒的遗传变异等方面的研究都取得了显著成果。但是现在猪场免疫中却存在很多问题，其中因为猪群感染情况复杂，免疫操作效果往往难以保证，主要原因有以下几项：病原的遗传变异弱毒疫苗的普遍使用改变了猪瘟病毒（H C V ）原有的生态环境和病毒群落。从20 世纪70 年代末开始，全世界HC 流行的特点均发生了重大变化，以温和型HC 为主。而近年来我国又出现了HC 疫情的反弹现象，许多猪场的免疫猪群频繁发病。因此，了解H C V 的遗传变异情况，了解HCV 疫苗毒与现流行毒之间的差异，对于防制 HC 是十分重要的。1986年 Lowings对世界上 20多个国家的115株HCV进行了序列比较、中和单抗反应性及内切酶分析后，将115株毒划分成2 个群（或血清亚型）。血清型1 有2 个亚群，主要包括Brescia 株（荷兰）、疫苗毒株和60 年代流行毒；血清型 Ⅱ有3 个亚群，主要包括Alfort 株（德国）和近10年来的流行毒。在此基础上，1999 年Sakoda 通过对4O 余株HCV 流行毒的序列分析，将HCV 分为 3 群：HCVI 称为古典HCV，以Brescia株为代表HCV2以Alfort株为代表HCV3与上述2 个群均有较大差异，包括日本、泰国和中国台湾等国家和地区20 世纪70～90 年代的流行毒株。 我国开展HCV 分子流行病学的研究工作虽然较迟，但在兰州兽医研究所和解放军军需大学等研究单位的不懈努力下，已使我国H C V 遗传发生关系全貌的系谱图日渐清晰。军需大学兽医研究所采用RT-PCR 方法，从我国10 个省、市、自治区收集23 个HCV 流行毒株中，扩增了HCV E2 基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定，通过计算机分析构建了系统发生树，并确定了它们之间的遗传相关性。结果表明，23 个流行毒株中的 18 株属基因 Ⅱ群，占78.26％；另外5 个流行株与传统的石门系强毒，兔化弱毒株属基因Ⅰ群，占21.74％。两群间测序区的核酸同源性只有78.9％。此外，根据序列差异程度将基因Ⅱ群流行株分为3 个亚群，各基因群HCV 在地域分布上末发现明显的特征性。该研究初步揭示了我国较大范围内流行的HCV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异，以及我国H C V 流行株在地域分布的多样性。近期HCV 流行毒与古典HCV 之间已有较大差异（核酸和氨基酸同源性分别为82.2％～84.3％和87.9％～90.0％），但根据中国兽药监察所进行的猪瘟兔化弱毒疫苗对不同HCV 野毒株的免疫保护相关性研究结果表明：虽然在我国不同地区所分离的HCV 野毒株在其病原生物学上有所差异，但用我国目前使用的猪瘟免化弱毒疫苗免疫的猪完全能够抵抗这些野毒的攻击。结果再一次证明：我国现用的猪瘟兔化弱毒疫苗对预防目前流行的H C V 是完全有效的。 我国研制的中国系（C系）猪瘟兔化弱毒是国际公认的最佳疫苗用株，很多欧亚国家采用了C系弱毒苗有效地控制了HC 流行。但我国近年来常有免疫失败的报道，其原因虽然很多，疫苗的质和量有着重要的影响。疫苗免疫效果通常以防止临床感染为标准。应用这一标准时，常有部分猪免疫后，抗体水平不能达到防止亚临床感染水平，这部分猪感染强毒后常可引起亚临床感染。此种亚临床感染猪虽无明显症状，但在其存活期终生带毒、散毒，成为H C V 主要储存宿主，剖检可见胸腺萎缩，淋巴结肿大。这些猪的存在，便可形成HC常发地区。因此，专家指出，疫苗应以能保护防止亚临床感染为标准。 用不同剂量的C 株苗免疫猪，证实免疫剂量与保护水平密切相关。剂量不足时，攻毒后不能阻止强毒在体内复制和带毒。免疫剂量提高到8 0 ～1 0 0 P D 5 0 （约3 2 0 ～4 0 0 R I D ，R I D 为兔体反应量），攻毒后能制止亚临床感染，所有耐过猪均不带毒。目前欧洲为消灭H C 亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用C 株疫苗免疫时，肌肉注射剂量为100PD50（400RID ）。我猪瘟细胞苗出厂检验以5 万倍稀释能致兔体热反应为合格，即每毫升原液含5 万RID。规定的免疫剂量为150RID，折算为37 PD50。这一剂量远低于国际标准，显然在HC 不稳定地区应用这一剂量，不足以切断HC 亚临床感染引起的恶性循环。 H C V 和牛病毒性腹泻病毒（B V D V）2 种瘟病毒之间有较密切的抗原性和血清学关系。两者同源性很高，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体。在西欧国家，猪B V D V 的感染率很高（2 0 ％～4 0 ％）。B V D V 感染妊娠母猪可引起繁殖障碍，病毒可经胎盘传染胎儿，使所产仔猪构成亚临床感染。国内生产厂家反映，用家兔测定牛睾丸原代细胞生产的猪瘟兔化弱毒疫苗效价时，各批次间相差悬殊。究其原因有多种，但其中最值得注意的是瘟病毒（B V D V ）污染。因为瘟病毒在体外培养大多不产生CPE，故不易引起检验人员注意。污染主要来源是小牛血清，从瘟病毒先天感染的小牛分离的血清含有感染性病毒，常规的热灭活又不能确保瘟病毒灭活。用BVDV 污染的HC 疫苗免疫母猪后，仔猪发生类似先天性HC 感染，死亡率增加，因此给生产造成很大损失。 疫苗的运输、保存、使用不当，亦易影响免疫效果。猪瘟冻干苗应在低温条件下运输和保存，稀释后应立即使用，不能存放过久。有人曾在夏季一个市场防疫注苗点进行试验，早晨刚稀释的疫苗经检验完全符合出厂标准，即每头份含150RID，但到傍晚，自注苗点抽检最后剩下1 瓶稀释的疫苗检测，每1 头份只有15个兔体反应量，在Id中效价已损失90％。因此，稀释后的疫苗如不能立即用完，应放在冰瓶内低温保存。此外，疫苗注射操作过程中的失误，如使用失真空的疫苗或过有效期的疫苗；消毒不严，造成潜伏期病毒的传播等都会影响疫苗的免疫效果。 我国各地对HC 的防制工作一般都很重视，但有些地区仍时有HC 暴发流行，免疫失败的现象也常有发生。其原因除免疫剂量不够，免疫覆盖率偏低以外，免疫程序不尽合理也是一个重要因素。为了寻求更加科学、合理、有效的猪瘟免疫程序，各地进行了大量试验研究。免疫程序的关键是排除母源抗体干扰，确定合适的首免日龄。门常平等（1982）报道母猪在配种前免疫接种的，所产仔猪血中母源抗体的中和效价，3 ～5 日龄时约为1 :64～128。母源抗体的半衰期约10d，仔猪20 日龄前可得到母源抗体的保护。25 日龄后保护力下降，至40 日龄已完全丧失对强毒的抵抗力，45 日龄前后母源抗体效价已降至l：4～8 猪瘟疫苗的仔猪首免日期，最好选定在仔猪持有的母源抗体不会影响疫苗的免疫效果而又能防御病毒感染的期间，即母源抗体为1 ：8 ～64 时。因此提出25 日龄和6 5日龄2 次免疫的建议，此种免疫程序目前已为多数猪场采用。如在母源抗体效价尚高时接种疫苗，即会被母源抗体中和掉部分弱毒，阻碍疫苗弱毒的复制，仔猪就不能产生坚强的主动免疫力。如果有其他免疫抑制疾病的影响，免疫程序还需要另做调整，而且目前猪群一般不只受一种疾病威胁。如猪繁殖与呼吸综合征（P R R S ）在猪群中的存在，会使猪体免疫力下降，从而影响HC 的免疫保护力。PRRS 所引起的最显著病理变化是严重损伤肺泡巨噬细胞，造成其大量破坏，并伴有循环淋巴细胞及黏膜纤毛清除系统的破坏，从而抑制免疫力，使猪对各种继发感染易感。PRRS 感染产生的免疫抑制，也可以恶化慢性传染性疾病，并使猪对其他疾病如猪瘟等各种疫苗的免疫应答下降，造成免疫失败。
第一，加强H C 诊断和免疫监测
典型HC 可主要根据临床症状和病理变化作出诊断，实验室诊断为辅助手段。非典型HC 由于症状不明显和缺乏特异性特征，通常需取决于实验室诊断。
实验室诊断目前常用的方法有：
①冰冻组织切片（或触片）的直接荧光抗体（F A ）试验。许多国家和地区已将该法作为执行消灭HC 规划的法定诊断方法，此法简便、快速可靠。作为FA 试验的样品应采自病死猪的扁桃体、脾、肾或回肠末端。②将病猪扁桃体和脾制成20g／L的混合匀浆后接种PK-15 细胞24～72h 以后，用FA 试验或酶标抗体检查证实培养物中的病毒（H C V 无C P E ）。此种病毒分离方法比FA 更为敏感。③经典的HC 诊断方法是接种易感猪和免疫猪，或用兔体交叉免疫试验（可区别兔毒和强毒）。④间接法酶联免疫吸附试验，可作为HCV 感染猪血清抗体的检测与分析。⑤为区分HCV 和BVDV 需借助单克隆抗体技术和核酸探针技术。
为了弄清群体的免疫水平和疫苗免疫效果，必须加强H C 免疫监测。杜念兴等（1 9 9 8）建立的P P A - E L I S A ，曾对抗体不同水平的猪进行攻毒保护试验。结果OD490 值在0 ．3 以上1 0 0 ％保护；≥ 0 ．1 7 至≤ 0 ．3 之间者，保护率在75 ％左右。据此制定了群体总保护率的估算公式：群体总保护率＝（≥ 0.3 的头数＋≥ 0.17 至<0.3 的头数Χ 75％）/ 总头数免疫良好的免疫群体保护率多在90% 以上，总保护率小于50％者为免疫无效或HC 不稳定地区，需加强免疫或采取措施消除不稳定因素。
总之，做好免疫监测是减少我国HC 发生的重要手段。应用免疫检测可随时掌握猪群的免疫状态，制定适合于该猪场合理的免疫程序，并随时淘汰免疫耐受猪（疫苗接种后不产生或仅产生低水平抗体的猪），保持猪群的整体免疫。此外，结合HCV 抗原检测，坚决淘汰隐性感染或潜伏感染的种公猪和母猪，消除引起仔猪先天感染和免疫耐受的传染源。
目前国内还没有统一的H C 免疫程序。刘劲松等（1991）在相同条件下对5 种常用的HC 免疫程序进行了比较研究。结果表明：在HC 控制区采用1 月龄一次免疫或2月龄一次免疫；在HC 未控制区采用超前免疫或1 月龄一次免疫。母猪的免疫应避开配种和妊娠期，以免引起胎盘感染或超前免疫时仔猪发生过敏性休克（可能由于母源抗体过高）。林毅等（2 0 0 0 ）提出，由于现在一些规模化养猪场实行28 日龄早期断奶，为便于生产实际操作和尽量减少应激次数，试验制定了28 日龄首免；70 日龄二免2 头份猪瘟疫苗的免疫程序。在母源抗体较高或未流行过HC 的猪场，选用此程序免疫较好。吴楚泓（2 0 0 0 ）在广东广三保养猪公司的试验结果表明，在无猪瘟流行的地区，仔猪在65 日龄时进行一次性大剂量（5 头份）免疫，抗体有效效价高于2 次免疫猪（35 日龄首免3 头份；65 日龄二免5 头份），与2 次免疫相比，既节省免疫费用，又可获得较好的免疫保护力。蔡葵蒸等（2002）试验指出，在猪瘟威胁区，免疫母猪所产仔猪以28日龄首免4 头份疫苗，55日龄二免2头份疫苗的免疫程序效果较为可靠。 为了排除母源抗体的干扰，使仔猪获得较强免疫力，对初生仔猪进行超前免疫（又称乳前免疫或零时免疫）已达成共识，并在生产中广泛应用，且日渐成熟。一般认为在超前- 次免疫后应在70 日龄前后进行第2 次免疫，才能保证绝大多数猪具有能抵抗HCV 感染的抗体水平。多数学者认为适当提高免疫剂量有利于提高抗体水平，同时加大剂量亦可中和一定的母源抗体。可供参考的免疫剂量为种猪4～5 头份；仔猪2 ～3 头份；仔猪母源抗体在1 ：32 以上时（2 5 日龄左右），以4 头份疫苗剂量的免疫效果最佳。 猪瘟弱毒疫苗的广泛应用，对于控制HC 的流行起到了关键作用。但是，由于用这类疫苗免疫后并没有彻底阻断HCV 的传递途径，H C V 野毒仍然存在并以低水平传播，致弱疫苗毒也存在因突变或与野毒发生重组而造成毒力返强的机率。另一方面，弱毒疫苗的普遍使用，促使了H C V 的变异这一事实已为近期流行毒与疫苗毒在分子水平上存在较大差异所证明。因此，研制可克服传统疫苗不足之处的新型疫苗是十分必要的。 利用真核细胞高效表达系统来表达HCV 免疫蛋白，并以此表达产物为抗原可制造疫苗。杆状病毒（baculovirus）昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白基因，而且大部分蛋白质的加工过程与哺乳动物细胞相同。Hulst 等（1993）将HCVE2 基因CDNA 重组入核型多角体病毒（ACNPV），并在SF21 细胞中表达。用20～ 100 mg 的表达蛋白免疫猪，可抵抗100LD50 的HCV 强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前，该蛋白的表达水平已被提高至60 μ g/mL，该疫苗于1998 年被列入欧洲药典。由于该疫苗生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，同时又可根据流行毒的变化，更换合适的E2 基因，因此具有广阔的应用前景。 以无致病力或低毒力的痘苗病毒或伪狂犬病病毒为载体，将HCVE2 基因与之重组研制出的基因重组疫苗，免疫动物后可对2 种病毒产生良好的保护力。但对此类疫苗的安全性和实用价值目前还有争议。因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机制，一旦将该病毒放入自然界中，有可能衍变出对人和动物有危害的病毒变种。 即D N A 疫苗。将外源基因克隆至真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA 直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达。产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。近年来有关质粒DNA 疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。在猪瘟D N A 疫苗方面，解放军军需大学作了初步研究，成功地保护了猪瘟强毒对猪的攻击。但要使DNA 疫苗的研制获得成功并得到推广应用，还有很长的路要走。 我国曾多次制定控制和消灭HC 规划，但由于种种原因未取得预期成效。美国在上世纪50 年代，HC 流行也很严重。1961 年美国农业部开始组织全国范围内消灭 HC，同年参众两院通过立法消灭HC，并由总统批准了国家消灭HC计划。经过16 年的努力，1978 年宣布在全国范围彻底消灭了HC。16 年间州和联邦共拨款1．4 亿美元用于执行消灭HC 计划，而16 年间猪场由于控制了疫病获利达15 亿美元。且由于消灭了H C ，美国猪产品可重返国际市场，所获利润远大于灭病开支。虽然两国国情、疫情不同，但美国的灭病经验仍有可借鉴之处。 | 
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发表于 2007-6-26 10:25:46
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