美国农业部研究机构利用纳米孔测序技术快速鉴定非洲猪瘟病毒基因组

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非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟病毒科家族的唯一成员，是一种大型（200nM）复杂的囊膜双链DNA病毒。ASFV可感染家猪和野猪，扩散快，致死率高（可达100%），对猪业造成严重的经济后果。

近期，美国农业部下属的研究机构在Journal of Clinical Microbiology杂志上发表了针对非洲猪瘟病毒的首个结合样品富集、纳米孔MinION测序技术、以及新型快速分析软件的报告，实现对该病毒基因组序列的真正实时检测。

由于目前尚无控制非洲猪瘟（ASF）的有效疫苗，基于检测追踪、流行病学调查、减少人员接触以及消毒等控制措施，在当病毒脱落或其他的病毒和细菌感染产生相似的症状时，这些方法就会变得非常复杂。因此，分子水平进行早期快速检测和诊断有益于早期发现和更加有效的控制猪瘟。

美国农业部国家兽医服务实验室等研究机构比较了现有的测序平台，发现基于NGS平台的工作流程需要大量资源进行样本和测序文库准备，检测周期长（最少17个小时来获取原始数据），仪器投入资本高。另外，ASFV基因组大小约为180kb，两端为反向重复序列，该病毒的大小也一直阻碍着获得其全基因组序列的研究工作。而在满足快速检测和鉴定ASFV的需求上，MinION测序仪具备了低前期投资成本、快速样本制备方案、可生成有效覆盖基因组的长读长序列、可直接读取DNA，并且能够实时生成数据的优势。

基于便携式MinION纳米孔测序，他们开发出了非洲猪瘟快速分析测序工具（ASF-FAST）和富集策略，能够在数分钟内获得并快速分析非洲猪瘟病毒基因组，该方法有助于高效的紧急管理和疾病控制干预，减少经济损失。结果显示测序开始后的6分钟内便检测到ASFV的特异读长，无论起始材料，均能够在10分钟内生成足够的数据完成ASFV的基因组分析（高达100%）。该研究成果发表在Journal of Clinical Microbiology杂志。DOI: 10.1128/JCM.01104-19。

在实验中，研究小组比较了未处理样品和富集样品的序列特异度和时间，发现从富集的样品中识别到ASFV基因组更快，更富特异性。在富集的样品中，生成总读长序列54743个，其中23208个含有ASFV特异性序列（42.39%），生成的第一个原始读长即识别到了99%的基因组；对于未处理的样品，生成了4307个总读长序列，其中868个含有ASFV特异性序列（20.15%）。另外，去除甲基化宿主DNA提升了病毒特异性测序性能。

在生成完整基因组序列所需的时间方面，富集样本速度更优于未处理样本：生成99%的基因组序列，富集后的样本仅需不到10分钟，而未处理样本则需要64分钟。证实将长读长纳米孔测序技术与ASF-FAST软件结合使用，能够经济快速，实时地从诊断样品中分离出完整的ASFV基因组。

在评估MinION平台用于流行病学评估的快速鉴定的可行性方面，作者使用ASF -FAST软件分析了四株遗传学上不同的ASFV分离株的序列数据。他们发现在测序运行开始的10分钟内，所有富集样本90%的基因组均得到了解析。使用新鲜的和冻干血液样本，全基因组序列可在约4小时内获得。

作者在文章最后表示，纳米孔技术作为一种重要的工具，能够被世界其它许多受ASFV威胁的地方和地区所利用进行快速监视，应用于那些没有复杂基础设施的实验室和现场。大多数实验室都可以以最小的资金投入轻松获得MinION设备，迅速拓展能力进行对ASFV的表征。

近期，中国科学院武汉病毒研究所刘翟课题组也利用纳米孔测序技术成功解析一例非洲猪瘟病毒基因组。

制版人：半夏

来源：BioArt