腐殖酸钠对大肠杆菌的抑制作用研究

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腐殖酸钠是用化学方法从风化煤、褐煤、泥炭中提出的一种有机弱酸盐，形状是棕黑色的轻质粉末，易溶于水，呈弱碱性，水溶液呈酱油色胶体溶液，它具有较强的吸附力和络合力，释放初生态，从而对某些细菌的生长有抑制作用（宦海霞等，２０１０）。众所周知，大肠杆菌是寄居在人和温血动物肠道中的正常菌群之一，少数具有致病性（韩立新等，２０１２）。大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种以败血症和剧烈腹泻为特征的急性传染病，常呈地方性流行或散发（姚新玲等，２０１０）。据新疆阿克苏地区畜牧兽医站报道，产前或长期给母猪饲喂腐殖酸钠，可使所产仔猪对肠道已有的大肠杆菌有较强的抵抗力（蒋安文等，２０００）。走访牧区蒙古族牧民，发现牧民在养羊过程中使用腐殖酸钠预防治疗羊腹泻。由于腐殖酸钠结构复杂，对大肠杆菌作用效果不明，本试验通过对分离于羊肠道的２株大肠杆菌进行体外抑菌试验，并对其细胞形态进行观察来研究腐殖酸钠对大肠杆菌是否有抑制作用，以期为今后深入探讨腐殖酸钠抑制大肠杆菌的机制提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料
供试菌株大肠杆菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４均由内蒙古农业大学兽医学院提供。腐殖酸钠购于天津市光复精细化工研究所，含量大于９９％。

1.2 菌种活化
将供试菌株大肠杆菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４分别接种于 ＬＢ斜面培养基上，于３７ ℃下培养２４ｈ进行活化传２代。

1.3 稀释平板计数法
取活化培养好的菌株，用无菌生理盐水稀释接入细菌计数液体培养基，使其终浓度为１０６ ＣＦＵ／ｍＬ。分别添加５％、１０％、１５％腐殖酸钠（ｍ／Ｖ），等量取出不同添加水平腐殖酸钠菌液调节ｐＨ７．３，３７ ℃静置培养。依菌株生长情况，取样时间选择为４、１２、２４、４８ｈ，细菌计数固体培养基（ｐＨ７．０）稀释平板法计数菌落（ＣＦＵ／ｍＬ），以不加腐殖酸钠的细菌培养液为空白对照，每个处理重复３次。测定不同水平腐殖酸钠及不同水平腐殖酸钠调节ｐＨ 后对大肠杆菌活菌数的影响。

1.4 透射电镜观察
选择大肠杆菌 Ｃ７８４菌株，分别接种于添加５％腐殖酸钠、添加５％腐殖酸钠调节ｐＨ７．３和 空 白 ＬＢ 固 体 培 养 基 中，３７ ℃培 养２４ｈ后收集菌体，按电镜样品制备及超薄切片技术（朱丽霞，１９８３）操作，用移液枪沿管壁缓慢加入３％戊二醛固定液，４℃静置１５～３０ｍｉｎ；１００００～１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上 清；用 吸 管 沿 管 壁 缓 慢 加 入３％戊二 醛，再 用 １％ 四 氧 化 锇 固 定，丙 酮 逐 级 脱 水，Ｅｐｏｎ８１２树脂包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，Ｈ－７０００型透射电镜观察。

1.5 统计分析
试验数据采用 ＳＰＳＳ１０．０统计软件中 Ｏｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡ 程序进行方差分析和 ＬＳＤ法进行显著性差异分析，结果用平均值±标准差表示，以Ｐ＜０．０５为差异显著性判断标准。

2、结果与分析

2.1 添加不同水平腐殖酸钠对大肠杆菌活菌数的影响
由表１可知，大肠杆菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌数均随腐殖酸钠添加量的增加，抑菌效果逐渐增强。其中大肠杆菌 Ｃ１２５在４和１２ｈ时，各浓度间大肠杆菌活菌数差异显著（Ｐ＜０．０５）；２４和４８ｈ时，添 加５％、１０％、１５％腐殖酸钠组大肠杆菌活菌数与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５），且添加１０％、１５％腐殖酸钠组与添 加５％腐 殖 酸 钠 组 相 比 差 异 显 著（Ｐ＜０．０５）。大 肠 杆 菌 Ｃ７８４在４ｈ时 的 活 菌 数 仅 添 加１５％腐 殖 酸 钠 组 与 对 照 组 相 比 差 异 显 著 （Ｐ ＜０．０５），其他组间差异均不显著（Ｐ＞０．０５）；１２ｈ时，添加１０％、１５％腐殖酸钠组大肠杆菌活菌数与对照组相比差异显著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸钠组与对照组相 比 差 异 不 显 著（Ｐ＞０．０５）；当 时 间 延 长到２４和４８ｈ时，各处理组大肠杆菌活菌数与对照组相比均差异显著（Ｐ＜０．０５）。

2.2 添加不同水平腐殖酸钠调节ｐＨ后对大肠杆菌活菌数的影响
由表２可知，调节ｐＨ后，大肠杆菌 Ｃ１２５、Ｃ７８４活菌数均随腐殖酸钠添加量的增高而降低。其中大肠杆菌 Ｃ１２５在４、１２和２４ｈ时，各处理组大肠杆菌活菌数与对照组相比均差异显著（Ｐ＜０．０５）；４８ｈ时，添加１０％、１５％腐殖酸钠组与对照组相比均差异显著（Ｐ＜０．０５），而添加５％腐殖酸钠组大肠杆菌活菌数与对照组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）。大肠杆菌 Ｃ７８４在４ｈ时，各处理组大肠杆菌活菌数与对照组相比差异均不显著 （Ｐ＞０．０５），时间延长到１２、２４和４８ｈ时，各处理组大肠杆菌活菌数 与 对 照 组 相 比 均 差 异 显 著（Ｐ＜０．０５），且各处理 组 间 差 异 显 著（Ｐ＜０．０５）。调 节 ｐＨ 后，腐殖酸钠对２株大肠杆菌依然有抑制作用，对于不同菌株抑制作用有差异。

2.3 透射电镜观察结果
经透射电镜观察发现，添加５％腐殖酸钠组的大肠杆菌细胞质固缩，出 现 空斑，细胞质解体形成小空泡，并连接成大空泡成为空腔（图１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）；而添加５％腐殖酸钠调节ｐＨ 组的大肠杆菌细胞内出现大量空泡，且空泡多集中在细胞膜周围（图１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）；对照组大肠杆菌菌体呈棒状，细胞壁完整、边缘清晰、平整，无缺陷，无裂痕，无质壁分离现象，细胞质、核致密均匀（图１Ｇ、１Ｈ、１Ｉ）。

３、讨论

随着腐殖酸钠本身化学结构、分离提纯技术方面研究的不断深化，其药用价值逐渐体现，而腐殖酸钠对有害菌抑制作用方面的研究较少。现阶段研究表明，腐殖酸钠不仅内服、外用均无不良反应，且静脉注射亦未见到中毒发生和任何副作用。夏学鹏等（２００９）用含３０％腐殖酸钠的水溶液对１４窝１１２头初生仔猪白痢病进行治疗试验，结果发现，仔猪按体重服药（２．５ｋｇ体 重 每 次５ｍＬ／头，２．５ｋｇ以 上 体重每次１０ｍＬ／头），２次／ｄ，对仔猪白痢病具有良好的治疗效果，治疗中除３头仔猪未愈外，其余１０９头仔猪均在服药后３ｄ内治愈，治愈率达９６％，表明腐殖酸钠对治疗仔猪白痢病具有见效快、成本低、复发率低的优势。腐殖酸钠之所以对动物拉稀、痢疾疗效较好，主要是它为高分子络合物，并含生物碱，故对于肠道炎性物和有毒物质有较强的吸附力，同时对肠道黏膜具有收敛作用，由于腐殖酸钠结构中含有各种活性基团，从而能收缩血管，降低毛细血管渗透性，起到消炎止血作用，因此具有增强机体免疫的能力。目前腐殖酸钠对细菌的体外抑菌试验文献报道极少，本试 验 在 这 方 面 进 行 了 初 步 尝 试，结 果 表明，初始不同腐殖酸钠添加水平对大肠杆菌 Ｃ１２５均有抑制作用，随时间的延长，抑制作用趋于一致；而对于大肠杆菌 Ｃ７８４，初始只有腐殖酸钠添加量足够高才会对其起到抑制作用，随时间的延长，组间差异越来越显著。不同水平腐殖酸钠添加水平作用于大肠杆菌 Ｃ１２５和 Ｃ７８４，在２４ｈ时，活 菌 数 与 对 照组相比显 著 降 低。在 添 加 不 同 水 平 腐 殖 酸 钠 调 节ｐＨ 试验中，大肠杆菌不同菌株活菌数的改变基本一致。腐殖酸钠作 用 于２株 大 肠 杆 菌，调 节 ｐＨ 与否在１２ｈ后均能达到抑制大肠杆菌的目的。透 射电镜观察发现，腐殖酸钠可使大肠杆菌细胞膜通透性发生改变，使细胞异常生长，抑制对数生长期的细胞分裂，使细胞质稀薄，细胞内部出现空泡，表明腐殖酸钠可有效抑制大肠杆菌生长。腐殖酸钠对大肠杆菌生长的抑制作用主要原因有：①腐殖酸钠改变了菌液ｐＨ 使菌处于过碱环 境，从 而 使 大 肠 杆 菌 的生长繁殖受到抑制；②腐殖酸钠形成柔性的两性空间构象后与细胞内膜作用，扰乱了膜脂分子的排列，改变了细胞膜的通透性，影响细胞膜的结构和功能，在细胞膜上形成了许多孔道，致使细胞内的原生质扩散并从孔道向胞外渗漏，造成紫外吸收值升高，影响了细菌的代谢系统，随着细菌细胞膜破损，最终引起细胞完全解体，从而起到抑菌、杀菌作用（宫霞等，２００７）。

4、结论

本试验结 果 表 明，添 加５％、１０％、１５％腐 殖 酸钠可使大肠杆菌活菌数明显降低；同一菌株随腐殖酸钠添加量增加，抑制效果越显著；不同菌株在相同处理条件下，随时间的延长，抑制作用越明显。

作者：娜仁高娃    来源：预混料家园

天侠剑客

腐植酸钠是个好东西，还有很多作用！