枯草芽孢杆菌发酵棉粕营养特性的研究

IMCTT

　　导读

　　随着畜牧业生产和饲料工业的发展，一些常规饲料，尤其是蛋白质饲料严重缺乏，越来越满足不了生产的需要。寻求非常规蛋白质饲料对我国畜牧业的发展起着非常重要的作用。而我国是产棉大国，棉籽产量居世界首位，而且棉籽经过加工榨油后的副产物棉籽饼粕是很好的蛋白质饲料。但是普通的棉籽饼粕具有抗营养因子和棉酚，使得棉籽饼粕不能大量使用。枯草芽孢杆菌生长速度快，营养需求简单，易于存活、定殖和繁殖，并且分泌多种酶和维生素，具有良好的发酵作用，因此利用微生物对棉粕进行生物发酵，消除抗营养因子，降低棉酚含量，提高棉粕的消化利用率具有重要意义。鲍振国等(2013)及和小黑等(2014)通过研究枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和热带假丝酵母发酵棉粕，发现棉粕经过微生物发酵后均能不同程度地分泌各种酶类，降解粗纤维，提高粗蛋白含量，而且将蛋白降解为易于机体吸收的小肽，并能降解抗营养因子植酸等。因此试验拟通过枯草芽孢杆菌对棉粕进行发酵，探究其发酵前后棉酚、常规营养物质、小肽和氨基酸的含量的变化，为发酵棉粕的营养价值评定提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1 试验样品
　　发酵底料由90%的棉粕和10%的玉米组成，采用枯草芽孢杆菌菌种为Z3，由新疆石河子大学动物营养实验室选育。

　　1.2 营养琼脂培养基
　　蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5和琼脂15g/L，pH 7.0，121℃条件下高压15min。

　　1.3 种子液培养
　　将枯草芽孢杆菌Z3挑取1环菌苔接入营养琼脂培养基，37℃培养24h后接入20mL(50mL三角瓶)营养肉汤培养基，37℃，200r/min摇动培养15h(一级菌种)，取一级菌种1mL接入50mL(150mL三角瓶)营养肉汤培养基，37℃，200r/min摇动培养15h(二级菌种)。

　　1.4 试验方法
　　1.4.1 发酵底物处理
　　试验组底物处理:将棉粕90和玉米粉l0g加入500mL三角瓶中混合均匀，然后加入蒸馏水30mL，充分搅拌，在0.056MPa，121℃条件下蒸汽灭菌20min，冷却后于无菌条件下接入枯草芽抱杆菌Z3二级种子液7mL，搅拌均匀，三角瓶4层纱布封口，于恒温培养箱37℃静止培养72h。发酵结束后，将发酵产物放入烘箱中45℃烘干48h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

　　对照组底物处理:将棉粕90和玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均匀，然后加入蒸馏水30mL，充分搅拌调湿，在0.056MPa，121℃条件下蒸汽灭菌20min，冷却后接入液体培养基(不含菌种)7mL，搅拌均匀，不经发酵，直接将其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

　　1.4.2 棉酚含量的测定
　　总棉酚(TG)采用ISO6866—1985方法测定，游离棉酚(FG)采用GB13086—1991方法测定，结合棉酚(BG)按照BG=TG－FG计算得出。游离棉酚脱毒率/%=(发酵前底物FG单位含量－发酵后底物FG校正含量)÷发酵前底物FG单位含量×100。常规营养指标的测定采用国标法(GB6435)。

　　1.4.3 小肽含量的测定
　　分别称取样品1g溶于8mL蒸溜水，在25℃空气浴摇床振荡提取2h，混合液离心4000r/min20min，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，4℃保存待测，采用高效液相色谱进行分析。色谱柱:型号TSKgelG2000SWXL，8mm×300min凝胶柱。流动相(体积比)∶水∶三氟乙酸为100%∶0.1%。检测波长:220nm。流速:1.0mL/min，柱温:30℃，进样体积:20μL。

　　以Gly－Leu(相对分子质量188u)、还原型谷耽甘肽(GSH，相对分子质量307u)、氧化型谷胱甘肽(GSSG，相对分子质量613u)和杆菌肽(相对分子质量1423u)作为相对分子质量标准建立保留时间与分子量的线性方程，经计算确定600、1000和1800u相对分子质量的保留时间。将样品在以上色谱条件下分析，选择这段时间内的峰，积分求得峰面积，相对分子质量大的先出峰，相对分子质量小的后出峰。

　　1.4.4 氨基酸含量的测定
　　样品粉末用甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶1)充分提取，提取质量浓度为40mg/mL，提取液过0.45μm水系滤膜，滤液进行氨基酸前处理操作。

　　取10μL稀释液，置于试管内，加100μL日常工作液，涡旋混匀，高速离心。上清液转入另一试管，氮吹。加入60μL衍生工作液，涡旋混匀，旋转离心。65℃温育15min，然后离心氮吹。加入100μL乙腈水混合液复溶，涡旋混匀，旋转离心。使用液质联用质谱仪检测样本。

　　液相和质谱仪器型号:液相型号，HPLC Ultimate3000;质谱型号，3200 Q TRAPLC－MS/MS;色谱柱，AAA C 18，5μm，150mm×4.6mm，柱温50℃，进样量10μL;流动相A，水+0.1%甲酸;流动相B，乙腈+0.1%甲酸;CUR，20.00;CAD，Me－dium;CXP，5.00;IS，5500.00;DP，35.0;GS1，55.00;TEM，580.00;EP，10.0;GS2，60.00。

　　2结果与分析

　　2.1 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对棉酚含量的影响

　　从表2可见:底物灭菌对照组相对于底物不灭菌对照组总棉酚、游离棉酚和结合棉酚含量显著降低(P＜0.05)，分别降低2146.67、536.83和1609.84mg/kg。发酵组和底物灭菌对照组相比，其总棉酚、游离棉酚和结合棉酚含量显著降低(P＜0.05)，分别降低531.67、101.00和430.66mg/kg。棉粕底物经过灭菌后脱毒率为74.77%，而经过灭菌后再发酵，脱毒率进一步显著提高，脱毒率为88.84%，由以上分析可以得出，底物经过灭菌和灭菌后发酵可以使大部分游离棉酚降解消除，部分结合棉酚和总棉酚也被降解。

　　2.2 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对常规营养成分的影响

　　从表3可见:底物不灭菌对照组、底物灭菌对照组和发酵组3组间的干物质差异不显著(P＞0.05);底物灭菌对照组和底物不灭菌对照组相比，粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、钙、磷和粗灰分含量差异不显著(P＞0.05);发酵组与底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组相比，粗蛋白含量显著增加(P＜0.05)，蛋白含量分别增加14.37%和13.79%，粗脂肪、ADF和NDF含量显著降低(P＜0.05)，磷和钙含量显著增加(P＜0.05)。底物经过灭菌后其常规营养成分含量基本不变，但是经过发酵后，其常规营养成分含量会有所变化，其中粗蛋白含量增加0.51%，其余常规营养成分含量下降。

　　2.3 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对小肽含量的影响

　　从表4可见:底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组小肽含量差异不显著(P＞0.05);发酵组棉粕中的小肽含量均高于未发酵的棉粕，且差异显著(P＜0.05)，其中小于600、600～1000和1000～1800u的小肽含量分别提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高压对小肽含量的产生影响不大，而经过发酵后小肽含量会明显的增加。

　　2.3 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对小肽含量的影响

　　从表4可见:底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组小肽含量差异不显著(P＞0.05);发酵组棉粕中的小肽含量均高于未发酵的棉粕，且差异显著(P＜0.05)，其中小于600、600～1000和1000～1800u的小肽含量分别提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高压对小肽含量的产生影响不大，而经过发酵后小肽含量会明显的增加。

　　3讨 论

　　利用微生物发酵棉粕，不仅可以降低棉粕中的棉酚含量，还可以提高棉粕的营养价值，改善棉粕源饲料蛋白质品质，同时可以产生多种消化酶使大分子物质分解为小肽物质及提高发酵产物的菌群数量，对提高棉粕源饲料的综合利用价值具有重要意义。

　　3.1 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对底物中棉酚含量和常规营养物质的影响

　　试验底物经过灭菌和灭菌后发酵都可以降低棉粕中棉酚的含量，说明高压灭菌可以破坏棉酚的结构，导致部分棉酚结构不完整，从而起到使棉酚含量降低的作用。高压灭菌的底物经过发酵后，可以显著的降低棉酚的含量，说明通过枯草芽孢杆菌发酵，能够达到降低棉粕棉酚含量的目的，这与贾晓锋等(2009)和魏二虹等(2010)利用生物发酵的研究结果相一致。张庆华等(2007)采用热带假丝酵母、拟内胞霉和植物乳杆菌协同固态发酵棉粕，显著的提高棉粕脱毒率和粗蛋白含量。吴伟伟等(2010)用黑曲霉与酿酒酵母混合固态发酵棉籽饼粕得到了同样的结果。研究发现，经过枯草芽孢杆菌发酵后，其蛋白水平会有一定的提高，可能主要与微生物的生长及菌体蛋白含量的增加和微生物发酵过程中分泌的酶含量的增加有关。同时枯草芽孢杆菌利用底物中的非蛋白氮将其转化为菌体蛋白或分泌蛋白，使发酵后蛋白含量提高。研究发现，使用热带假丝酵母和黑曲霉复合发酵棉粕显著提高粗蛋白含量的同时提高棉粕钙和磷的含量，降低粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量，这与研究的结果一致。这主要是由于微生物生长代谢过程中，氧化消耗能量，使能量物质减少，因此钙和磷在干物质中的比例就相对提高，而且微生物能够利用并且分解纤维素、半纤维素和木质素，将其转化为寡糖，使粗纤维含量降低。

　　3.2 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对底物中小肽和氨基酸含量的影响

　　研究利用枯草芽孢杆菌发酵棉粕底物，发现经过发酵后小肽的含量和氨基酸的含量显著提高，许多研究表明微生物发酵可将底物中蛋白质降解为小分子蛋白和氨基酸等，显著提高饲料中氨基酸的含量。使用热带假丝酵母JD－9和干酪乳杆菌MX－48发酵棉粕，发酵后棉粕中小肽含量显著的提高。可能是利用微生物发酵使得很多难利用的大分子物质被降解，产生了很多易于被吸收的小分子物质、小肽类物质和游离氨基酸，显著提高饲料的营养价值。

　　4结 论

　　枯草芽孢杆菌发酵棉粕能很大程度的降低游离棉酚的含量，降低率达到88.84%。同时经过发酵后蛋白质含量显著提高5.2%，显著的降低粗脂肪和粗纤维的含量。增加底物中肽类物质的含量，相对分子质量小于600、600～1000和1000～1800u小肽含量分别提高12.4%、1.45%和1.793%，而且必需氨基酸苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸分别提高8.45%、6.25%、24.1%、3.5%、12.3%和9.52%。

　　注：本文由生物饲料开发国家工程研究中心（BFC）小编整理发布，如有任何建议或意见及投稿等，请您加小编微信（13260429991）交流互动。

　　参考文献略
　　责编：马维军；审阅：陈达 博士
　　来源：饲料研究；作者：孙焕林，孙新文，李洪，张文举