简介:

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)， 俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪流产、早产、产木乃伊胎儿和仔猪呼吸 道症状及死亡为特征的传染病。该病自上世纪出现以来，给世界养猪业造成了严 重的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，我国将其列 为二类动物疫病。对蓝耳病的诊断和预防一直是研究热点。本研究旨在建立一种 高致病性蓝耳病的分子诊断方法，探讨研制核酸疫苗的可行性，取得了如下初步 结果。 1.用Marc-145细胞分离了高致病性蓝耳病病毒甘肃株（GS株），对其基因全 序列进行了测定，利用生物信息学软件对其结构蛋白进行了分析，并对其抗原表 位做了预测。 2.通过序列分析设计合成了3条特异性引物，运用一步法RT-PCR，初步建立 了高致病性蓝耳病病毒的分子诊断方法，试验结果显示，该法具有快速、特异和 敏感等特点，可用于临床样品的快速检测。 3.以ORF3和ORF5抗原基因作为核酸疫苗研究的目的基因，用pBudCE4.1载体 构建了真核表达载体pBud-GP3和pBud-GP5。用脂质体法将pBud-GP3和pBud-GP5 分别转染Marc-145细胞，通过RT-PCR和荧光抗体检测，目的基因在Marc-145细胞 中获得了表达；以BALB/c小鼠为动物模型，通过肌肉注射重组质粒进行免疫接种， 用间接ELISA检测抗PRRSV抗体。结果显示，pBud-GP3和pBud-GP5能够有效诱导 机体产生体液免疫,说明ORF3和ORF5抗原基因作为PRRSV核酸疫苗的候选基因 是可行的。 4.选用IFN-γ基因作分子佐剂，构建了pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重组质 粒。将pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5质粒转染Marc-145细胞，通过RT-PCR和荧光 抗体检测重组质粒在体外的表达情况。然后通过肌肉接种免疫BALB/c小鼠，用 ELISA法检测免疫抗体水平；流式细胞术检测T淋巴细胞亚型。结果显示： pBud-IFN-GP3和pBud-IFN-GP5重组质粒可增强小鼠细胞免疫应答，IFN-γ发挥 了免疫佐剂的作用，增强了DNA疫苗的免疫原性，是一种很良好的免疫佐剂。同 时，为了研究CD58分子作为免疫佐剂的可行性，构建了pBud-CD-GP3和 pBud-CD-GP5重组质粒。将pBud-CD-GP3和pBud-CD-GP5重组质粒分别转染 Marc-145细胞，RT-PCR和荧光抗体检测结果表明，CD58分子、GP3和GP5在体外 获得了表达。为进一步通过动物模型来研究CD58分子的免疫作用奠定了基础。