实验室工作须知及简单操作方法

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一、实验须知
在微生物的实验中，要求工作谨慎，严防实验室污染，防止事故，有科学态度。
1.严格防止病原微生物散布
第一，在实验室工作，应穿戴工作衣帽，每天实验结束后，要将这些衣帽浸于消毒药水中(如5％石炭酸)或高压消毒后再进行洗涤。
第二，沾有病原微生物的器皿及废弃培养物，应置于指定的地点，消毒后再进行洗涤。检查用过的动物尸体、脏器、血液等病料，应严加消毒，深埋或焚烧。
第三，接种环、接种针等器械，用前用后必须置火焰中烧灼。
第四，含有培养物的试管，应竖列在试管架上，不可平放在桌子上，以防其中液体流出，污染桌面和地面。

第五，实验室中禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔和标签等物，也不要以手指等与面部接触。
第六，进行危险病科检验时不要互相交谈或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。
第七，实验室中若发生意外，如工作人员吸入细菌，划破皮肤，细菌或病料污染桌面或地面时，人员应立即自行处理，必要时到医院就医，被病原微生物污染的地点，应敷以浓消毒药(5％石炭酸等)覆盖过 夜。
第八，菌种或毒种不得随意带出实验室，若必需带出时，应严格按规章制度办理。
第九，工作完毕后应先用消毒药水泡手，后用清水冲洗。
2.预防火灾发生
一切易燃品应远离火源。不可将酒精灯倾向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。电炉用完后应立即断电。电器发生故障应立即修理。
3.标记和记录
标记和记录所有各种试剂、染料、培养物等，均需标记明确。每日操作及观察结果，均应详细记录。
4.保持清洁卫生与秩序井然
每日工作前，应清洁地面、桌面。实验室中的物资、器具，存放要有一定位置，工作结束后放回原处或指定地点。每日下班前，搞好实验室的清洁卫生和器具整理。
二、玻璃器皿的准备
微生物实验室应用的玻璃器皿种类很多，在选购时注意各种规格和质量，一般应能耐受多次高温灭菌，且以中性者为宜。玻璃器皿用前必须干燥清洁，而且要绝对无菌。

1.新购入玻璃器皿的处理
新购的玻璃器皿，常附有游离碱质，不可直接使用，应先在1％～2％盐酸溶液中浸泡数小时，以中和其碱质，然后再用肥皂水及清水刷洗，以除去遗留的酸质。
2.用过的玻璃器皿的消毒和处理
凡被病原微生物沾污过的玻璃器皿，在洗涤前必须进行严格的消毒。
第一，一般玻璃器皿(如平皿、试管、烧杯、烧瓶等)均可置高压消毒器内在15磅压力下消毒20～30分钟。
第二，吸管、载玻片、盖玻片等可浸泡于5％石炭酸溶液或2％～3％来苏儿溶液中浸泡48小时。浸泡吸管的玻璃筒底部应垫以棉花，以防投入吸管时碰破。

第三，盛有固体培养基(如琼脂)或沾有油脂(如液体石蜡或凡士林等)的玻璃器皿，应于消毒后，随即趁热将内容物倒净，用温水冲洗，再以5％肥皂水煮沸5分钟，然后以清水反复冲洗数次，倒立使之干燥。
3.玻璃器皿的洗涤
第一，将消毒处理过的玻璃器皿浸泡于洗衣粉水中，用试管毛刷反复刷去油脂和污垢，然后用自来水冲洗数次，最后用蒸馏水冲洗。
第二，经清水冲洗后，如发现玻璃器皿上仍有油迹时，可放入1％～5％苏打水或洗衣粉水中煮沸半小时，再用毛刷刷去油脂和污垢，最后用清水或蒸馏水冲洗干净。
第三，吸管的洗涤：①将吸管从消毒剂中取出后，先用细铁丝取出管口的棉塞。若棉塞太紧不易取出时，可将铁丝尖端压扁，插入棉塞和管壁之间，轻轻一转，即可将棉塞拉出。②将吸管浸泡于5％热洗衣粉中，在细铁丝一端，缠以少许棉花，用以刷洗管内的油脂和污垢。③用胶皮管1根，一端接冲棉球，一端接吸管的尖端，在流动的清水或自来水中反复吸冲数次，最后用蒸馏水吸冲数次，倒立于垫有纱布的铁丝筐或其他容器中。

4.玻璃器皿的干燥
洗净的玻璃器皿通常倒立于干燥架上，令其自然干燥，必要时也可放在50℃左右干燥箱中加速干燥。当然温度不宜太高，以免造成破裂。干燥后以干净的纱布或毛巾擦去水迹，再作进一步的处理。
5.玻璃器皿的包装
玻璃器皿在消毒之前，须包装妥当，以免消毒后又被杂菌所污染。各种玻璃器皿的包装方法如下：
第一，一般玻璃器皿(试管、三角瓶)的包装，先做好大小适宜的棉塞或纱布塞，将试管或三角瓶塞好，外面再用纸包扎。烧杯可直接用纸包扎。
第二，吸管先用细铁丝或长针头塞少许棉花于吸管口端，以免使用时将病原微生物吸入口中，同时又可滤过从口中吹出的空气。棉花应大小适度，以不紧不松为宜。最后将吸管一一分别用纸包裹，再用其他纸每10支包成1束。

第三，平皿、培养扁瓶、青霉素瓶等，用无油质的纸将其单个或数个包成1包，置金属盒内或直接进行消毒。
6.载玻片、盖玻片的处理
用过的载玻片和盖玻片，须分别浸泡于2％来苏儿或5％石炭酸溶液内消毒，经48小时后取出，再放入含5％洗衣粉的水中煮沸30分钟，用清水冲洗干净，试干保存，或浸于95％酒精中备用。
7.玻璃器皿用前的消毒
普通玻璃器皿在用前应经干热消毒法(160～180℃，1～2小时)消毒，也可用高压消毒法(15磅压力下，20～30分钟)消毒。
8.玻璃器皿云雾状污垢的处理
凡玻璃器皿上有云雾状而不能用普通方法洗净时，可用清洁液浸泡24小时，再以清水洗去清洁液，然后用洗衣粉水刷洗干净为止。若仍洗不净时应废弃。清洁液可重复应用多次，直至颜色变为蓝绿色或黑色为止。

清洁液的配制：取重铬酸钾10克，溶于63毫升常温清水中，配成重铬酸钾饱和溶液。再吸取此溶液35毫升，加入粗质浓硫酸1000毫升中即成。
三、细菌涂片的制备及染色
1.细菌涂片的制备
(1)玻片准备：载玻片应该清洁、透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开。如有残余油渍，可按下列方法处理：①滴上95％酒精2～3滴，用洁净纱布擦拭，然后在在酒精灯火焰上轻轻通过几次。②若上法仍未能去除油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，再在酒精灯火焰上轻轻通过。
(2)涂片：①液体材料(如液体培养物、血液、渗出液)，可直接用灭菌接种环取一环材料，置于玻片中央，均匀地涂布成适当大小的薄层。②固体材料(如菌落、脓、粪便等)，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用来菌接种环取少量液体，在液体中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。③组织脏器材料，先用镊子夹住局部，然后用灭菌的剪刀取1小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。如有多个样品同时需要制成涂片，只要染色方法相同，也可以在同一张玻片上，先用蜡笔划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

(3)干燥：上述涂片，均应让其自然干燥。
(4)固定：有火焰和化学两种固定方法。
①火焰固定：将干燥好的涂片涂面向上，以其背面在酒精灯上来回通过数次，略作加热固定。
②化学固定：干燥涂片用甲醇固定。
2.染色
(1)革兰氏染色：①将已干燥的涂片用火焰固定。②在固定好的涂片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1～2分钟，水洗。③加革兰氏碘溶液于涂片上媒染，作用1～3分钟，水洗。④加95％酒精于涂片上脱色，约30秒钟，水洗。⑤加稀释石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染10～30秒钟，水洗。⑥吸干或自然干燥，镜检可见：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

(2)瑞氏染色法:涂片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或者看情况补充滴加。经1～3分钟再加约与染色液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使与染液混匀。约经5分钟左右，直接用水冲洗(不可先将染液倾去)，吸干或烘干，镜检可见：细菌为蓝色，组织、细胞等物呈其他颜色。
(3)染色液的制备：
①革兰氏染色液的配制：
结晶紫染液：甲液：结晶紫2克，95％酒精20毫升；乙液：草酸铵0.8克，蒸馏水80毫升。
先将甲液稀释5倍，加20毫升，再加乙液80毫升，混合即成。此液可较久储存。革兰氏碘溶液：碘片1克，碘化钾2克，蒸馏水300毫升。

先将碘化钾加入3～5毫升的蒸馏水中溶解后再加碘片，用力摇匀，使碘片完全溶解后再加蒸馏水至足量(直接将碘片与碘化钾加入蒸馏水中，则碘片不能溶解)。革兰氏碘溶液不能久藏，1次不宜配制过多。
复染剂：番红(沙黄)复染液：2.5％番红纯酒精溶液10毫升，蒸馏水90毫升，混合即成。碱性复红复染液：碱性复红0.1克，蒸馏水100毫升。
②瑞氏染色液的配制：瑞氏染色剂粉0.1克，纯粹白甘油1毫升，中性甲醇60毫升。
置染料于一干净的乳钵内，加甘油后研磨至细末，再加入甲醇使其溶解。溶解后盛于棕色瓶中，经1周后，过滤，装于中性的的棕色瓶中，保存暗处。该染色剂保存时间愈久，染色的色泽愈鲜。

四、病毒的鸡胚培养
许多病毒均能在鸡胚上发育繁殖。因此，利用鸡胚培养病毒就成为病毒学上的一种常用的方法，用它可以分离、鉴定某些病毒，制备一些抗原，生产一部分疫苗。
(一)材料与设备
(1)常选用健康白色鸡的受精蛋，通常用产后10天之内的新鲜鸡蛋。
(2)孵化器可购置1具小型孵化器。
(3)检蛋蛋灯及暗室检蛋灯分固定及手持式两种。
①固定式检蛋灯：为一方形木盒，在底部或一侧装100W灯泡1个。上盖开一蛋形孔，周围包以棉布或胶皮，使之适于放置鸡蛋而不露光，在暗室中即可检蛋或定胎位。如无暗室，用黑布覆盖检查者的头部及木盒，也能检蛋。

②手持式检蛋灯：为一有柄圆形筒，内装60W灯泡1个，筒端口缘包以胶皮，柄上附开关，在暗室中持灯将筒口罩于竖立蛋上，即可观察胚胎发育状况，使用方便。
(4)开蛋器市上买的钢锥或兽用采血针头，均可用来钻孔。牙科磨牙机或电烙器，可用于开蛋窗。
(5)蛋盘及蛋座蛋盘为盒形木制，在上层板上开略小于鸡蛋的圆形或椭圆形孔数行，圆形孔可竖立放置待检蛋，椭圆形孔可横卧放置待检蛋。定胎位后，接种、解剖及固定培养时，使用此盘。
蛋座为小方形木盒，上有圆形或椭圆形孔1个，供接种或解剖收获时用。
(6)接种罩及紫外线灯接种或收获时，为了避免污染及传染，必须在接种罩中操作。罩内装置紫外线灯，以便消毒。

除上述材料与设备外，还需1～5毫升注射器、胶皮乳头、无菌滴管、玻璃纸或电工用透明胶纸、病毒保存液(缓冲甘油液或50％兔血清缓冲盐水)、灭菌培养皿、乳钵、玻璃研磨器、镊子、剪子以及各种消毒液(3％碘酊、酒精棉球、3％来苏儿)等。
(二)操作技术
1.鸡胚的孵化及检蛋
将选好的鸡蛋，先用温水洗净，并用酒精纱布擦拭后，放入37.5～38℃，湿度为45％～60％的孵蛋箱内，每日孵蛋2～3次。孵后第四天开始用检蛋灯照视发育情况，若仅见模糊的蛋黄黑影，无鸡胚迹象，则为未受精蛋；4日后若见清晰血管小团，其中有鸡胚暗影，较大的鸡胚则可见到胚动，则为活鸡胚；鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落，则为濒死或死亡鸡胚。

2.鸡胚的接种法
包括卵黄囊接种法、绒毛尿囊膜接种法、尿囊接种法、囊膜接种法、静脉接种法、脑内接种法等。现将绒毛尿囊膜接种法及尿囊接种法介绍如下：
(1)绒毛尿囊膜接种法：
①接种步骤：选用孵化10～12天的鸡胚，划出气室及绒毛尿囊膜的发育面，在绒毛尿囊膜处(靠近胚胎而无大血管处)蛋壳上，用碘酊及酒精消毒后，锉一个三角形或方形裂痕，除去蛋壳造成“蛋窗”，注意勿伤及蛋壳膜。另在气室中心钻小孔，将蛋横卧于蛋盘(座)上，在壳膜窗上滴无菌盐水1滴，以针尖将蛋壳膜划破一小孔，不可伤及下面的绒毛尿囊膜，然后用胶皮乳头置于气室端之小孔处往外吸气，使盐水渗入壳膜与绒毛尿囊膜的裂隙内，此时绒毛尿囊膜即下陷，与壳膜完全分离，而形成人工气室。以注射器注入0.05毫升病毒液于绒毛尿囊膜表面(应于造蛋窗后的1～2小时接种，否则干燥后不能用)，然后用玻璃纸盖于蛋窗上，周围涂以溶化的石蜡密封。同时封闭气室端小孔。横卧于蛋盘上，放在35～37℃温箱内，不能翻动。每日自蛋窗检查1次，如病毒发育良好，则鸡胚通常在48～96小时内死亡。

②收获方法：将待收获的鸡蛋蛋窗用碘酊消毒，用灭菌镊子撕掉玻璃纸，扩大蛋窗，除去蛋壳膜，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用小剪子沿人工气室周围将接种的绒毛尿囊膜全部剪下，放置在双碟或玻璃板上，观察病变。将病变显著的部分，放入灭菌小瓶内保存。
(2)尿囊接种法
①接种步骤：选用孵化10～11天的鸡胚经照视后，划出气室和胎位，在鸡胚旁无大血管处用铅笔划一记号，用碘酊和酒精消毒后，以灭菌钢锥在接种处钻一小孔，只破蛋壳而不破壳膜。针头没小孔避开鸡胚斜向刺入0.5～1.0厘米处，注入0.1～0.2毫升病毒悬液。用石蜡封口后，置温箱内孵化。每日翻蛋两次，检查一次。

②直立收获方法：收获时间须根据所感染病毒种类而定。收获前置冰箱中冰冻一夜，以免解剖时出血。收获时将鸡蛋放在蛋架上，用碘酊和酒精将气室端消毒，用灭菌镊子除去气室部蛋壳及蛋壳膜，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破，用吸管吸取尿囊液。每一鸡胚约可得尿囊液5～6毫升，贮入小瓶中冰冻保存。??

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对生物实验室很有用:hehes:

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