酶制剂实验指导

李-磊

实验一  α-淀粉酶活力的测定

一、实验目的

1. 掌握测定α-淀粉酶活力的原理；

2. 学习并掌握测定α-淀粉酶活力的实验操作。

二、实验原理

α-淀粉酶能将淀粉分子链中α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度和酶活力有关，可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

    酶活力的定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），于60℃、pH＝6.0条件，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。

三、实验器材

1. 实验材料：所购α-淀粉酶的固体酶粉

2. 试剂及溶液

（1）原碘液  称取碘（I2）11g、碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

（2）稀碘液  吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

（3） 20g/L可溶性淀粉溶液  称取可溶性淀粉（以绝干计）2.000g，精确至0.001g，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL，此溶液需要当天配制。

（4）磷酸缓冲液（pH＝6.0）  称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解定容至1000mL。配好后用pH计校正。

3. 仪器和设备

（1）分光光度计  应符合GB9721的有关规定

（2）恒温水浴（60±0.2）℃。

（3）秒表

（4）试管  25mm×200mm

四、实验步骤

1. 待测酶液的制备  称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7～5.6u/mL范围内），摇匀。通过4层纱布过滤，滤液供测定用。（此溶液需要当天配制）

2. 测定

（1） 吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。（小三角瓶中进行）

（2）加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即记时，摇匀，准确反应5min。

（3）立即吸取反应液1.00 mL于稀碘液5.00 mL中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度（A）。根据其吸光度查附表，求得测试酶液的浓度（c）。

五、实验结果

1.  实验结果的计算公式：        X=  c ×n

式中，X――样品的酶活力（u/g，或u/mL）

          c――测试酶液的浓度（u/mL）

          n――样品的稀释倍数

    所得结果表示至整数。

2. 平行试验相对误差不得超过2%。

实验二 蛋白酶活性的测定

一,目的要求 学会蛋白酶活性的测定方法.

二,实验原理

蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光光度法测定.

三,仪器,材料与试剂

1,苯酚试剂加水稀释1倍左右,用NaOH标定至1mol/L使用.盛在有色瓶中保存.

2,10%三氯醋酸溶液

3,0.4mol/L碳酸钠溶液:称取42.4g无水碳酸钠,用水溶解,定容至1 000mL.

4,适当pH缓冲液(供不同蛋白质使用):例如0.02mol/L,pH7.5磷酸缓冲液.

5,2%酪蛋白溶液:称取酪蛋白2g,用少量0.5mol/LNaOH溶液湿润后,用各种酶适宜的缓冲液稀释,在沸水液中加热溶解,冷却后用相应的缓冲液定容至100mL.

6,0.1%标准酪氨酸溶液:准确称取酪氨酸(预先在105°C干燥2h)0.1g,用0.2mol/L HCl溶解并定容至100mL.使用时再稀释成不同浓度.

四,实验步骤

1,将标准酪氨酸溶液配成0~100ug/mL的各种不同溶液.分别吸收1mL,各加入0.4mol/LNa2CO3溶液5mL及福林试剂1mL,置于40°C显色15min,分别测定OD680,以酪氨酸的浓度为横坐标,OD680为坐标,绘出标准曲线.

2,取酶液1mL,预热至40°C,加入预热的2%酪蛋白溶液1mL,于40°C反应10min,反应结束时加入10%三氯醋酸溶液2mL,立即摇匀,静置10min后过滤.取滤液1mL按标准曲线制作时相同的步骤,测定OD680.空白实验时,先加三氯醋酸溶液,然后再加入底物和酶液,同样测定OD680.

3,计算

在上述条件下,每分钟催化酪蛋白水解生成1mg酪氨酸的酶量定义为1个活力单位.

酶活力(单位)= OD680 x Kx n /10

式中: OD680——在680nm波长下,样品测定与空白实验的光密度差;

K——常数,有标准曲线得出,数值上等于OD680为1的时候所相当的酪氨酸的毫克数;

n——反应液体积;

10——反应时间为10min.

实验三、纤维素（CMC）酶活力的测定方法

一、             原理

纤维素酶在一定的温度和pH条件下，将纤维素底物（CMC，羧甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。通过其在550nm测其吸光度，可得到还原糖生成量，计算出β－葡聚糖酶的酶活力。以此代表纤维素（CMC）酶的总酶活力。

酶活单位定义

在（40±0.2）℃、pH 4.2条件下，在1min内水解羧甲基纤维素钠底物，产生相当于1微克葡萄糖的还原糖的酶量，为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。

二、             试剂和溶液

　　除非另有规定，试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。

                    i.             羧甲基纤维素钠（CMC－Na）

中国医药公司上海化学试剂公司产，分析纯，在25℃,2%水溶液粘度300～800厘泊尔。

                 ii.             磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液:

    甲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。

    乙液：称取柠檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。.

使用溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均匀，用pH计校正至pH为（4.2 ±0.05）,备用。

             iii.             1%羧甲基纤维素钠（CMC－Na）溶液

称取1g羧甲基纤维素钠，精确至1mg，缓缓加入pH为4.2 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液80ml，水浴加热至全部溶解。冷却后用2M　HCL或NaOH调节溶液的pH到（4.2 ±0.05），搅拌均匀，定容至100ml，再用二层纱布过滤。此溶液在4oC冰箱贮存，有效期为3天。

                 iv.             3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂:

    取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g， 氢氧化钠10g，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色试剂瓶中，于暗处放置1周后使用。

　 :注：在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。

                    v.             1%(W/V)葡萄糖标准贮备溶液

称取预先于（103±2）℃下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，即为1%浓度的葡萄糖标准溶液。

D.2.5葡萄糖标准使用溶液

分别吸取1%葡萄糖标准贮备溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、　5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，制成每ml分别含葡萄糖200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200 μg的标准使用溶液。

b)      仪器和设备

  　除普通实验室仪器外，还应有：

                    i.             恒温水浴锅(40±0.2) oC。

D.3.2 分光光度计

                 ii.             酸度计　精度±0.01pH  。

             iii.             分析天平　感量0.1mg。

                 iv.             秒表或定时钟。

c)      测定步骤

                    i.             标准曲线的制作

按表D.1，分别吸取标准葡萄糖使用溶液、缓冲液和DNS试剂于各管中（每管号平平行3个样），混匀。

将标准管同时置于沸水浴中，反应7min，取出，迅速冷却至室温，准确加入蒸馏水10ml，混匀。用10mm比色杯，以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm处测吸光度。以葡萄糖量为横座标，以吸光度为纵座标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数（r）应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。对每个新配制的DNS溶液制作新的标准曲线。

表D.1　葡萄糖标准曲线

    

管　　号

    

  

标准葡萄糖使用溶液

  

  

  

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ml)

  

  

  

DNS试剂吸取量

  

(ml)

  

  

  

浓度（μg/ml）

  

  

  

吸取量（ml）

  

    

0

    

  

0

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

    

1

    

  

200

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

    

2

    

  

400

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

    

3

    

  

600

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

    

4

    

  

800

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

    

5

    

  

1000

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

       3.0

  

    

6

    

  

1200

  

  

  

0.50

  

  

  

1.5

  

  

  

3.0

  

                 ii.             样品的测定

1.      待测酶液的制备

固体酶：根据样品酶活大小，称取2g－10g固体酶样，精确至0.1mg，加入40－200ml蒸馏水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用滤纸过滤，再根据样品酶活性大小，二次稀释至适宜浓度（使供试样液与空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之间，下同）。液体酶：精确量取液体酶若干ml，根据样品酶活力大小，直接用蒸馏水稀释至适宜浓度，待测。

2.      操作程序

――取三支18×180mm试管（一支空白管。二支样品管）。

――分别向三支试管中准确加入稀释好的待测酶液0.50ml 。

――将三支试管放入（40±0.2）oC水浴中预热5min，同时将测定底物（1%羧甲基纤维素钠溶液）置同一温度水浴中预热5min。

――分别向二支样品管中加入1.5ml　1%羧甲基纤维素钠溶液，向空白管中加入3mlDNS试剂，准确计时，反应10min，取出。

――迅速、准确向二支样品管中加入3ml DNS试剂，于空白管中加入1.5ml　1%羧甲基纤维素钠溶液，摇匀。将三支试管同时放入沸水浴中，待水浴中的水重新沸腾时开始准确计时，反应7min，取出，迅速冷却至室温。向三支试管中各加入10ml蒸馏水，混匀。

――以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长550nm下，用10mm比色杯，分别测二支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

d)      酶活力计算

按照下式（D.1）计算样品的纤维素CMC酶的活力：

　　　　　A×V×N

X1＝                        …………………………………………………(D.1)

                  0.5×W×10

   式中：

　　　　　X1――――纤维素CMC酶活力，u/g　；

　　　　　A――――根据吸光度在标准曲线上查得（或从回归方程计算出）的还原糖生成量，μg；

　　　　　V――――样品提取时加入水的量（ml）；

　　　　　N――――样品二次稀释时的稀释倍数；

0.5―――参与反应的酶量（ml）；

W――――样品重量（g）；

10――――反应时间（min）。

e)      精密度

同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。

crsshan

楼主的方法不错啊