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发表于 2011-6-22 13:45:45
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黄曲霉毒素
图1 黄曲霉菌孢子头
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的杂环化合物，它的代谢产物主要有B1、B2、G1、G2、M1和M2等类型。
培养基中的黄曲霉
黄曲霉毒素非常耐热，只有通过长时间高温（100—120℃）作用，如高压消毒和锻烧才能使其大部分失活。在一般情况下，巴氏消毒法或烘烤面包的热度（中心最高温度为100℃）并不足以使黄曲霉毒素完全灭活。这些毒素对强酸和强碱较敏感。因此，在提炼油时，用氢氧化钠萃取游离脂肪酸的工艺可以进一步破坏毒素的活性。
尽管黄曲霉毒素的毒性很强，但必须一次性摄入含有大量黄曲霉毒素的霉变食品才会发生急性中毒疾病。对于人类，多见由于持续性摄入亚急性量而造成慢性中毒的情况，例如引起肝硬变和肝脏纤维样病变。不仅霉变食品，那些在运输过程中污染灰尘而霉变的粮食和花生中也可能带有黄曲霉毒素而危害人类。毒素在肝脏、心肌和肌肉中逐渐积累而增强它的毒性。对肝脏的直接损伤可能导致基因畸变（畸胎或死胎），但大量的动物（鼠类、鸟类和鱼类）试验结果证明，它们有很强的致癌性，主要是诱发肝癌。目前有人认为还会诱发肾癌。黄曲霉毒素的致癌性与其它致癌物如二甲基亚硝胺的作用有明显的关系。
显微镜下的黄曲霉的孢子囊
在各类黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素Ｂ1的毒性最大，其次是M1、G1、M2、B2和G2.因此，许多国家规定了黄曲霉毒素在食品中的极限值，即食品中的黄曲霉毒素含量不允许超过此值。
黄曲霉是温暖地区常见的占优势的霉菌，其生长温度范围在4—50℃之间，最适生长温度为25—40℃。黄曲霉毒素形成的最低温度为5—12℃，最高为45℃，最适温度为20—30℃（28℃）。在肉制品中，当温度在10℃以下时，则不生成黄曲霉毒素。曲霉比其它霉菌更耐旱，而且环境的酸碱性对其影响不大，在pH2—9的条件下都能生成黄曲霉毒素，不过在pH2.5—6.0之间的酸性条件下，毒素的生成量最大。黄曲霉能在含氧量极低的环境中生长，在缺氧环境中发酵。即使在充填二氧化碳的冷库中，黄曲霉的生长也不受影响，不过能明显地延缓黄曲霉毒素的形成。
黄曲霉和寄生曲霉广泛存在于土壤、灰尘、植物及其果实上。特别是在热带和亚热带的核果类和谷类上更为常见。所以必须注意检查特别容易受黄曲霉毒素污染的食品原材料，以及用这些原材料加工的食品中的黄曲霉毒素，这些食品有花生、核桃、开心果、杏仁、桃仁和李仁、椰丝、芝麻和各种粮食。
显微镜下黄曲霉的气生菌丝和分生孢子
【概述】
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质.黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至死亡.在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见,其毒性和致癌性也最强.
黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。
【发现】
上世纪60年代,在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关.进一步的调研证明,这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污染,这些研究工作最终使人们发现了黄曲霉(Aspergillus.flavus)产生的有毒代谢物质,黄曲霉毒素(Aflatoxins).是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物,特曲霉也能产生黄曲霉毒素,但产量较少.产生的黄曲霉毒素主要有B1,B2 ,G1 ,G2 以及另外两种代谢产物M1 ,M2.其中M1 和M2是从牛奶中分离出来的.B1,B2 ,G1 ,G2 ,M1 和M2的在分子结构上十分接近.
【化学结构】
黄曲霉毒素(Aflatoxins),是一组化学结构类似的化合物,目前已分离鉴定出12种,包括B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物.即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素).前者为基本毒性结构,后者与致癌有关.M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物.黄曲霉毒素的主要分子型式含 B1,B2,G1,G2 ,M1,M2等.其中M1和M2 主要存在于牛奶中.B1为毒性及致癌性最强的物质.
《黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2化学结构式》
黄曲霉毒素B1 （4-羟基衍生物）
分子式：C17H12O6
分子量：312.27
黄曲霉毒素B2
黄曲霉毒素G1
黄曲霉毒素 G2
黄曲霉毒素M1
黄曲霉毒素M2
【理化特性】
在紫外线下,黄曲霉毒素B1,B2发蓝色荧光,黄曲霉毒素G1,G2发绿色荧光.黄曲霉毒素的相对分子量为312-346.难溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有机溶剂,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中.一般在中性溶液中较稳定,但在强酸性溶液中稍有分解,在pH9-10的强碱溶液中分解迅速.其纯品为无色结晶,耐高温,黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。
【主要来源】
黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。当粮食未能及时晒干及储藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。
黄曲霉菌污染玉米
正常大米一般为白色，我们平时放久的大米会有淡黄的颜色，大米变黄是因为大米在储存过程中由于自身水分含量高，在酶的作用下产生热，致使霉菌繁殖，出现霉变现象并呈现出黄色。霉菌中包含真菌产生的黄曲霉素，它是岛青霉、桔青霉、黄绿青霉的有毒代谢物的统称。
【分布】
黄曲霉毒素存在于土壤,动植物,各种坚果,特别是花生和核桃中.在大豆,稻谷,玉米,通心粉,调味品,牛奶,奶制品,食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素.一般在热带和亚热带地区,食品中黄曲霉毒素的检出率比较高,在我国,产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉,1980年测定了从17个省粮食中分离的黄曲霉1660株,广西地区的产毒黄曲霉最多,检出率为58%.总的分布情况为:华中,华南,华北产毒株多,产毒量也大,东北,西北地区较少。
【对人畜的危害】
黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关.黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构,是产生毒性的重要结构.研究表明,黄曲霉毒素的细胞毒作用,是干扰信息RNA和DNA的合成,进而干扰细胞蛋白质的合成,导致动物全身性损害(Nibbelink,1988).黄光琪等(1993)研究指出,黄曲霉毒素B1能与tRNA结合形成加成物,黄曲霉毒素-tRNA加成物能抑制tRNA与某些氨基酸结合的活性,对蛋白质生物合成中的必需氨基酸,如赖氨酸,亮氨酸,精氨酸和甘氨酸与tRNA的结合,均有不同的抑制作用,从而在翻译水平上干扰了蛋白质生物合成,影响细胞代谢.
1,黄曲霉毒素与动物疾病
黄曲霉毒素中毒(Aflatoxicosis)主要对动物肝脏的伤害,受伤害的个体因动物种类,年龄,性别和营养状态而异.研究结果表明,黄曲霉毒素可导致肝功能下降,降低牛奶产量和产蛋率.并使动物的免疫力降低,易受有害微生物的感染.此外,长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒.通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感.黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱,降低生育能力.降低饲料利用率,贫血等.黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降,而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2.据美国农业经济学家统计,由于食用黄曲霉毒素污染的饲料,每年至少要使美国畜牧业遭受10%的经济损失.在我国,由此而带来的畜牧业损失可能会更大.
2,黄曲霉毒素与人类的健康
人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物.对于这一污染的预防是非常困难的,其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的.国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产,并制定相关的标准监督企业执行.但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制.在发展中国家,食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性.亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明,食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变 (Liver Cell Cancer,LCC) 呈正相关性.长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌,胃癌,肠癌等疾病的主要原因.1988年国际肿瘤研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC) 将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物.除此以外,黄曲霉毒素与其它致病因素(如肝炎病毒)等对人类疾病的诱发具有叠加效应.
黄曲霉毒素Bl的半数致死量为0.36毫克/公斤体重,属特剧毒的毒物范围(动物半数致死量<10毫克/公斤=它的毒性比氰化钾大10倍,比砒霜大68倍).它引起人的中毒主要是损害肝脏,发生肝炎,肝硬化, 肝坏死等.临床表现有胃部不适,食欲减退,恶心,呕吐,腹胀及肝区触痛等;严重者出现水肿,昏迷,以至抽搐而死.黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质.其致癌力是奶油黄的900倍,比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍,比3,4苯并芘大4000倍.它主要诱使动物发生肝癌,也能诱发胃癌,肾癌,直肠癌及乳腺,卵巢,小肠等部位的癌症.
检验检疫方法:
1,薄层层析法
薄层层析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年,它被列为AOAC (Association of Official Agricultural Chemists)标准方法,该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.
2,液相色谱法
液相色谱(Liquid Chromatography,LC)与薄层层析在许多方面具有相似性,二者互相补充.通常用TLC进行前期的条件设定,选择适宜的分离条件后,再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定.
3,免疫化学分析方法
利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法,也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA),酶联免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫层析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定.
(1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-HPLC法
免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果,但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素(如黄曲霉毒素B1)含量,而且易出现假阳性结果,难以控制.免疫亲和柱法(包括荧光光度法和HPLC法)却能达到既定量准确又快速简便的要求.
免疫亲和柱的使用可以避免传统TLC和HPLC的缺点,同时免疫亲和柱与TLC和HPLC法结合可以大大提高工作效率,提高灵敏度和准确度.
黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段,用荧光计,紫外灯作为检测工具的快速分析方法.它克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒,异味的有机溶剂,毒害操作人员和污染环境的缺点.同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快,一个样品只需10-15min,比传统方法快几个小时甚至几天时间;仪器设备轻便容易携带,自动化程度高 ,操作简单,直接读出测试结果,可以在小型实验或现场使用.可以进行黄曲霉毒素总量 (B1B2G1G2) 的测定,检测限可达到1ug/kg,达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg.
黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全,可靠,灵敏度和准确度高.它采用单克隆抗体免疫技术,可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来,分离效率和回收率高.
分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤,稀释后,用免疫亲和柱净化,以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高测定灵敏度,然后用荧光分光光度计进行定量.也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中,对黄曲霉毒素B1,B2,G1,B2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上,然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg.
(2) 酶联免疫吸附法:
1996年,Nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便,敏感,特异,可作为多种抗原或抗体的测定,20世纪70年代后期,该方法引入真菌毒素的检测中,下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素B1.
原理:将已知抗原吸附在固态载体表面,洗除末吸附抗原,加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液,竞争培养后,在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分,然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物,与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合,再加入酶底物.在酶的催化作用下,底物发生降解反应,产生有色物质,通过酶标检测仪测出酶底物的降解量,从而推知被测样品中的抗原量.
(3) 微柱筛选法 可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的总量.
原理 样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后,在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环,其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光,则样品为阴性(方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量.
(4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法
一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5—10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品,这种方法能估算黄曲霉毒素的含量,非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。
【特性】
1、AFT的毒性极强
远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。
2、AFT具耐热性
一般烹调加工温度不能将其破坏，裂解温度为280℃。在水中溶解度较低，溶于油及一些有机溶剂，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。
3、食品中所污染的主要是黄曲霉毒素Bl，其毒性目前一般认为有三种临床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性：
(1)急性中毒：
它是一种剧毒物质，毒性比KCN大10倍，比砒霜大68倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。它的毒害作用，无论对任何动物，主要变化是肝脏，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。
(2)慢性中毒：
长期摄入小剂量的黄曲霉毒素则造成慢性中毒。其主要变化特征为肝脏出现慢性损伤，如肝实质细胞变性、肝硬化等。出现动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状
(3)致癌性：
AFT是目前所知致癌性最强的化学物质
其致癌特点是：
A 致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的实验肿瘤；
B 致癌强度大，其致癌能力比六六六大1万倍；
C 可诱发多种癌，AFT主要诱发肝癌，还可话互胃癌、肾癌、泪腺癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，还可出现畸胎。
以上转自：http://www.china-pig.cn/zhu/zblw/14754.html
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