多克隆抗体的制备

回空 · 发表于 2011-1-20 05:57:37

多克隆抗体的制备

一、抗原抗体反应

二、多克隆抗体制备原理

三、抗原的制备与纯化

四、抗原纯度的鉴定方法

五、免疫佐剂

六、免疫动物的选择

七、动物的免疫

八、多克隆抗体制备的方法

九、抗血清效价及纯度鉴定

十、抗血清的纯化和保存

一、抗原抗体反应

（一）抗原

1 抗原的概念：抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质。抗原的两种特性：免疫原性和抗原性免疫原性（immunogenicity),即能与TC 或BC 抗原受体结合，刺激细胞活化、增殖、分化，产生抗体和致敏淋巴细胞的性能。抗原性（antigenicity),能与相应的免疫应答产物抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的性能。

2 抗原的分类：根据抗原的性质分类：完全抗原（complete antigen）同时具备抗原性和免疫原性的物质。半抗原（hapten）（incomplete antigen）只有抗原性而不具有免疫原性的物质。半抗原与蛋白质类物质结合可具有免疫原性即成为完全抗原。赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。依抗原不同的物理性状分类：颗粒抗原：细胞，微生物之类属颗粒抗原；可溶性抗原蛋白质一般属于可溶性胶体抗原。颗粒性抗原的免疫原性一般强于可溶性胶体抗原的免疫原性。

3 抗原的免疫原性：

异物性：抗原的异物性（foreignness）是指一种物质被机体免疫系统识别为非己的抗原异物的特性，特指外源性物质。外源性抗原作为异物一般具有免疫原性，可刺激机体产生免疫应答，最终被机体清除，如感染的病原微生物。异物性的物质包括以下几类：① 异种物质如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性；② 同种异体物质如：ABO 血型抗原、人类主要组织相容性抗原； ③ 自身抗原物质如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。

一定的理化性状：大分子胶体物质凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa 以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和结构从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。完整性：具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白。

宿主遗传性：抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关, 同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为免疫应答基（immune response,Ir)。

4 抗原的特异性：抗原特异性（antigenic specificity）：是指抗原与其受体（TCR 和BCR）和免疫应答产物抗体专一结合的性质。即抗原物质进入机体被淋巴细胞识别，产生的是针对蛋白质、多糖及其它大分子抗原物质的不同构成部位特异的免疫答。

抗原决定簇（基）（antigenic determinant,AD) 被抗原受体TCR 和BCR 特异性识别的抗原部分称为抗原决定基或表（epitope)。是抗原特异性的物质基础。体内存在的具有不同特异性的淋巴细胞克隆能识别不同的抗原决定基。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD 与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD ，一种AD 决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性。

载体决定基和半抗原决定基：一个抗原分子具有载体决定簇和半抗原决定簇。

载体效应：初次免疫和再次免疫时，半抗原需要在相同的载体上才能使机体产生抗半抗原抗体，称为载体效应，在免疫应答中，B 细胞识别半抗原决定簇，是抗体产生细胞，T 细胞识别载体决定簇，是辅助B 细胞产生抗体。半抗原决定簇又称B 细胞决定簇；载体决定簇又称T 细胞决定簇。

（二）抗体

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体，是介导体液免疫的重要效应分子，主要存在于血清等体液中。

（三）抗原抗体反应

抗原抗体反应:是指抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。

原理：抗原抗体反应的物质基础是抗原分子表面的抗原决定定簇与抗体分子高变区之间

的互补结合，在适宜条件下出现可见反应。这种互补性是由抗原、抗体分子的空间构型所决

定的，是抗原决定簇与抗体高变区的沟槽分子表面的结合。抗原抗体之间的结合力参与并促

进抗原与相应抗体结合形成抗原抗体复合物。

抗原抗体反应的特点：

1 Ag 与Ab 结合的特异性（Lock and Key Concept）：抗原与抗体的结合具有高度特异性，即一种抗原通常只能与由它刺激所产生的抗体结合。是由抗原决定簇与抗体分子高变区之间空间构型的互补性所决定的。这种特异性如同钥匙和锁的关系

2 可逆性：抗原与抗体的结合为非共价的可逆性结合，它们之间空间结构的互补程度不同，结合力强弱也不一样，互补程度越高，则亲和力越大。氢键（ Hydrogen bonds）、离子键（Electrostatic bonds）、范德华力（Van der Waal forces）、疏水力（Hydrophobic bonds）。

抗体的亲和力（ affinity ）指一个抗体的一个抗原结合位点与抗原决定簇之间以非共价键相互作用强度。

抗体的亲合力（avidity）指抗体多价情况下对抗原的结合力称为亲合力。与单价Ig 的亲和力、Ig 的价数、抗原决定簇的数目有关。

3 比例性在抗原抗体特异性反应时，抗原抗体复合物的生成量与反应物的浓度有关。在恒定量的抗体中逐渐加入抗原量，免疫复合物的沉淀量逐渐增加然后又逐渐减少。

抗体过剩区：抗原总量不足以和全部抗体反应，在上清中可检测到游离的抗体，此为前带现象（prezone)；

等价区：加入的抗原量足以结合所有的抗体上清中检测不到游离的抗原或游离的抗体；

抗原过剩区：抗原量多于结合所有抗体所需的量，导致被沉淀（或被凝集）的抗体减少，此为后带现象（postzone)

4 阶段性Ag-Ab 反应的两个阶段：Aggregation and Precipitation or agglutination。

（四）抗原抗体反应的影响因素

① 抗原：抗原的理化性状、抗原决定簇的种类和数目。

② 抗体：特异性和亲和力、抗体来源、效价。

③ 电解质：常用0.85%NaCl 溶液或各种缓冲液作Ag 及Ab 的稀释液及反应液。；

④ 酸碱度：抗原抗体必须在合适的pH 环境中进行。抗原抗体反应一般在pH 为6~9为宜。

⑤ 温度：适当的温度加速抗原抗体反应的进行。常用的抗原抗体反应温度为37oC

（五）抗原抗体复合物解离

抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素:：① 抗体对相应抗原的亲和力；② 环境因素对复合物的影响。高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离；低亲和性抗体与抗原结合形成的复合物较易解离。解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结构、活性及特异性。

（六）交叉反应

共同抗原：两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原

交叉反应:
一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。

二、多克隆抗体制备原理

1 多克隆抗体的概念

多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。★ 机体内所产生多克隆免

疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。

2 多克隆抗体产生原理

初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Mø 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。

二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。

机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。

三、抗原的制备与纯化

1 颗粒抗原制备

细胞抗原：自然界中某些细胞组分的抗原性不仅取决于组成它的蛋白分子的一级结构，有时也要求完整的二级结构甚至三级结构。将细胞组分整体分离直接免疫动物会得到事半功倍的效果。

利用细胞个组分质量大小的不同，通过密度梯度离心的方法，在适当的介质中，各组分沉降于离心管内的不同区域，分别收集，即可得到所需组分。

细菌类抗原：细菌类抗原首先应该选好免疫用菌株，在适宜条件下培养增殖，刮取菌苔，经杀菌后稀释成适当浓度作为抗原液。

2 可溶性抗原制备与纯化

可溶性抗原包括蛋白质、多肽、脂蛋白、铁蛋白、类脂、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体等均为良好的抗原。为制备特异性高的抗血清一般均需加以纯化。抗原纯化常用的方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。

3 半抗原的免疫原制备法

半抗原：多肽，甾族激素，药物，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。

半抗原免疫原制备: 将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。

物理吸附方法: 通过电荷和微孔吸附半抗原。

物理吸附剂有：碳粉，聚乙，葡聚糖硫酸钠，甲基纤维素等。

化学方法: 应用某些功能团试剂把半抗原连接到载体上。

载体: 包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，血蓝蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚赖酸等。半抗原结合到载体上的数目直接与抗体生成有关，半抗原连接在载体上的数目至少有20 个以上，才能有效地产生抗体。

四、抗原纯度的鉴定方法

蛋白质抗原纯化以及抗血清制备后均需作纯度鉴定，通常采用的鉴定方法有

1、醋酸纤维薄膜电泳，此法可以初步鉴定抗原纯度，不需要抗血清，较为方便。

2、SDS-PAGE，是鉴定纯度最为常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以从样品的泳动率初步了解其分子量。还可以和标准样品相比较，对各电泳区带的物质加以定型。

3、双向琼脂扩散法，是鉴定抗原纯度最为简单的方法，主要是通过各种特异性抗血清鉴定抗原纯度，首先必须有抗体才能用这一方法。

五、免疫佐剂

1 佐剂的概念和种类

佐剂的概念：佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。

佐剂的种类

1）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗) 短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌的内毒素。

2）无机化合物：氢氧化铝、明矾等

3）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（polyI:C)

4）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油

2 佐剂的生物学作用

增加抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效的免疫原；提高抗体的滴度，提高初次免疫应答和再次免疫应答抗体的滴度；改变抗体的类型，由产生IgM 转变成IgG；引起或增强迟发型超敏反应。

3 佐剂的作用机制

① 改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统；

② 刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力；

③ 刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。

4 弗氏佐剂

弗氏不完全佐剂（IFA) 石蜡油+羊毛脂

弗氏完全佐剂 (CFA) 石蜡油+羊毛脂+ 卡介苗

抗原和佐剂的比例为 1：1，由于佐剂是油剂，加抗原后要充分混合成乳剂。

六、动物的选择

1 动物的种类和种系：供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。

2 动物的生理状况：由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体的效价有很大的差异。与动物的年龄和营养状况密切相关。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。

3 抗血清的需要量：根据实验中抗血清的需要量，选用最经济的动物和免疫动物的只数。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。

七、动物的免疫

1 抗原剂量：抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。

免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般情况下，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，家兔为500μg～1 000μg/kg/次，加强剂量为首次剂量的1／2～1／3。

2 注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。对抗原吸收的速度：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌肉>皮下>皮内>掌内=跖内皮下。基础免疫应选择缓慢吸收的途径，延长抗原刺激时间。

3 加强免疫时间：与抗原的理化性质、剂量、进入途径、机体状况和所处的免疫应答阶段有关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答的早期，应延长间隔时间。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的2~3 周，以后每7~10 天加强一次。加佐剂间隔时间应为2 周左右。注射的Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。

4 加强免疫次数：抗原的免疫原性强弱和动物对抗原的敏感性有关。抗原免疫原性弱，需多次加强才能获满意的抗血清。得制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。最简单的方法是直接检测血清中的抗体滴度，观察免疫效果。

5 佐剂应用：加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10 倍以上。

八、多克隆抗体制备方法

1 多克隆抗体制备方法流程

纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。

九、抗血清效价及纯度鉴定

抗血清效价：指抗血清中抗体含量的某一相应的近似值。

抗血清纯度：指只与相应的抗原产生沉淀线，而不与其它血清学无关的抗原物质发生反应。抗血清效价鉴定方法：双向免疫扩散试验、凝集反应。结果判定：根据出现沉淀线的数量和位置来鉴定免疫血清的纯度和效价。

十、抗血清的纯化和保存

由抗原免疫动物制得的多克隆抗血清是一个非常复杂的复合体。包括了全部血清成分。对于一些试验来说，免疫血清无需纯化即可应用，如用于FACS 分析，大多数ELISA，以及细胞毒试验等。有些试验则要求应用进一步纯化的抗体，如需要精确知道抗体浓度时进行化学修饰标记荧光素时或放射物时，以及制备抗体片段（F（ab’）2，Fab 等）时。抗体存在于抗血清中时，其活性相对稳定。每一次的纯化过程都会使抗体的活性和绝对量损失。因此抗体的纯化要根据实验需要进行，尽量减少不必要的纯化过程。主要纯化方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换剂层析法、免疫吸附亲和层析法。

免疫血清的保存：制备的抗血清如果保存得当，可数月至数年效价无明显变化。常用的保存方法：⑴ 冰冻保存； ⑵ 冷冻干燥保存； ⑶ 加防腐剂保存； ⑷ 中性甘油保存；

⑸ 除菌保存。