不同糖对四种粕蛋白保护效果的研究

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　　不同糖对四种粕蛋白保护效果的研究

　　Study on the protective effect of treated protein meal with different sugar

　　摘要：本文以甲醛处理作为对照，研究4种不同的糖(戊糖、己酮糖、己醛糖、蔗糖)浓度3%，140℃加热90min条件下对大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、棉籽粕蛋白质保护效果。试验安排为单因素多水平试验设计，共24个处理组。采用半体内法(in situ) 和三步法分别评定各处理组产品的瘤胃蛋白降解率和小肠消化率。结果表明：在此试验条件下，甲醛、戊糖、己醛糖、蔗糖、己酮糖加热保护处理对大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕都具有一定的保护作用，其中戊糖的保护效果最为理想，优于甲醛处理组，其他各保护剂的效果均低于甲醛。大豆粕和菜籽粕对不同保护剂处理较为敏感，而棉籽粕和花生粕次之。
　　关键词：糖及粕类资源;瘤胃蛋白保护;美拉德反应
　　Key words: sugar and meal resource;rumen protected protein;　Maillard reaction;
　　Abstract：The protective effect of treated protein meal with different sugar under the condition of sugar dosage 3% heated for 90min(140℃),based on the formaldehyde treatment as positive control. The experience was examined in one-factor multy-level design, total 24 experimental treatments. The rumen degradable rate of protected protein and rate of small intestinal digestibility was estimated by nylon bag technique and the three-step procedure. The result suggest: there is certain protective effect for all protein meal by sugar treated. Protective effect of xylose treatment is better than formaldehyde, compare with other sugur treatment. The treatments of soybean meal and rapeseed meal which treated by the different sugar is more effective than Canola meal and Peanut meal.
　　前言
　　蛋白质饲料是制约动物生产性能发挥的关键因素之一，在中国，大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕是生产中常用的优质蛋白饲料，然而它们的蛋白质在瘤胃中降解率较高，特别是豆粕的降解率高达60%(瘤胃12小时)以上 ，这一方面造成蛋白资源的浪费，同时也不能满足高产奶牛及生长发育快的反刍动物对未降解蛋白的需要。因此，对于那些降解率较高的优质蛋白质，有必要采取适当的保护措施，在保证能满足微生物对可降解氮源需要的前提下，增加小肠可利用蛋白质数量，满足高产奶牛对蛋白质的需要，提高了蛋白质饲料的利用效率，节约蛋白质资源，缓解我国饲料蛋白资源缺乏的现状。
　　对蛋白质饲料进行保护处理，已有报道在蛋白质饲料中添加甲醛可以有效的保护蛋白质在瘤胃免受微生物的降解，尽管其保护效果得到公认，但是因为甲醛具有毒性且易在畜体内残留，有悖于绿色养殖的观念，这使甲醛保护法受到质疑，也限制了在实际生产中的应用。
　　杨威试验结果(杨威，2007)[1]表明：利用美拉德反应在140℃-90min-3%的条件下大豆粕可以获得最低的瘤胃蛋白降解率及较高的小肠可吸收蛋白，具有较好的保护作用。美拉德反应是氨基酸和蛋白之间的反应，那么用其他糖处理保护大豆粕是否也可以获得同样的保护作用及这些不同的糖对其他粕类蛋白是否具有保护效果都值得我们进一步研究。目前，国内在此方面的研究还尚未见报道，本试验拟从美拉德反应的原理入手，研究不同糖对不同饼粕的保护效果，为拓展蛋白保护方法开拓思路，提供参考。
　　1.材料与方法：
　　1.1试验材料与设备：
　　保护剂 戊糖：食品级，含量99%;
　　己酮糖、己醛糖、蔗糖，甲醛 (甲醛浓度为38%)
　　蛋白质饲料原料：
　　大豆粕：饲料级，CP44.39%;
　　棉籽粕：饲料级，CP 44.48%
　　菜籽粕：饲料级，CP 36.79%
　　花生粕：饲料级，CP 45.20%
　　试剂及仪器：
　　胃蛋白酶(sigma7012，活性在2500-3500u/mgCP);
　　胰液素(sigma7545)，成分：淀粉酶、胰岛素、脂肪酶、核糖核酸酶、蛋白酶;
　　凯氏定氮仪KJ2300(瑞士FOSS公司);
　　CR226型10000g冷冻离心机(日本日立公司);
　　DSHZ恒温水域摇床(江苏太仓试验仪器公司);
　　50ml离心管、实验室常规试剂及分析仪器;
　　尼龙袋等。
　　1.2试验设计：
　　用戊糖(X)、己酮糖(F)、己醛糖(G)、蔗糖(S)、甲醛分别保护处理大豆粕(SM)、棉籽粕(CM) 、菜籽粕(RM)、花生粕(PM)，共得到24个处理组，每处理6个重复，共144个样品,试验设计见表1
　　表1 三因素随机试验安排

保护剂粕类	X	S	F	G	甲醛	CK
SM	X-SM	S-SM	F-SM	G-SM	甲醛-SM	SM
CM	X-CM	S-CM	F-CM	G-CM	甲醛-CM	CM
RM	X-RM	S-RM	F-RM	G-RM	甲醛-RM	RM
PM	X-PM	S-PM	F-PM	G-PM	甲醛-PM	PM

　　1.3 试验方法：
　　半体内法(in situ): 用尼龙袋测定保护处理大豆粕2h、6h、12h、24h、48h瘤胃降解率，(参照冯仰廉,1989)[2];
　　体外法 (in vitro): 用三步法(Calsamiglia,1995方法)[3]测定小肠消化率，计算小肠可吸收蛋白，综合评定各处理组的蛋白保护效果。小肠可吸收蛋白=(1-12h瘤胃蛋白降解率%)*12h残渣的小肠消化率%。
　　粗蛋白质含量分析采用GB/T 6432—94
　　样品处理：大豆粕粉碎过20目筛，按糖保护剂：大豆粕(DM)=3：100的比例进行配制。然后140℃加热90min，室温回潮，备用;甲醛保护样品的制备：按100g大豆粕蛋白质称甲醛0.6g用水稀释10倍后喷雾，与大豆粕混合均匀，密封24小时后备用。
　　1.4试验数据的统计分析
　　采用SPSS13.0一般线性分析单因变量多因素方差分析，用Duncan进行显著性检验。用平均值 ± MSD表示。为了对所有处理组进行筛选，通过T检验得出处理组之间平均值的差异显著性。
　　2.试验结果与分析：
　　2.1各因素对DM瘤胃降解率的影响
　　用甲醛、戊糖、蔗糖、己酮糖、己醛糖对大豆粕、棉籽粕、菜籽粕和花生粕进行保护处理，其瘤胃DM降解率见图1-图4。图2所示棉籽粕与图4所示的花生粕DM降解率中戊糖处理各时间点均显著低于对照组，其他糖的保护处理与对照组较为相似。从图1，图3可以看出，在菜籽粕中的各保护剂在各时间点的DM降解率与大豆粕相似，即各保护剂处理组的DM降解率在各时间点的DM降解率都按一定的顺序依次下降，戊糖处理组最低。
　　不同保护剂处理对大豆粕瘤胃DM降解率的影响
　　
　　不同保护剂处理对棉籽粕瘤胃DM降解率的影响
　　
　　不同保护剂处理对菜籽粕DM降解率的影响
　　
　　不同保护剂处理对花生粕瘤胃DM降解率的影响
　　
　　综上所述，甲醛和各种醣类保护剂对大豆粕、菜籽粕、棉籽粕、花生粕在瘤胃的DM降解率都有影响，经过保护处理四种粕DM瘤胃降解率都有明显下降，特别是瘤胃发酵6小时以后效果比较显著。在五种保护剂中戊糖的作用最为明显，其次是甲醛，己醛糖、己酮糖和蔗糖。
　　2.2不同保护剂对四种蛋白质饲料的保护效果
　　以瘘管牛为试验动物，用尼龙袋(in situ)法测得了经过不同保护剂处理的蛋白质饲料在瘤胃12h的蛋白质降解率，用三步法测定了处理样品在小肠的消化率并推导出了小肠可吸收蛋白率。
　　2.2.1不同保护剂处理对大豆粕蛋白质保护效果
　　表2 大豆粕的瘤胃蛋白降解率(%)、小肠消化率(%)及小肠可吸收蛋白(%)
　　Table 2 RDP,ID and IADP of SBM

	12h蛋白降解率(RDP)	小肠消化率(ID)	小肠可吸收蛋白(IADP)
对照	73.04±2.61f	75.63±1.88b	20.39±2.33a
戊糖	15.72±1.81a	64.92±1.51a	54.71±1.18d
蔗糖	61.85±2.94d	75.05±3.17b	28.63±6.53b
己酮糖	67.38 ± 6.63e	74.07±3.10b	26.22±5.23b
己醛糖	40.49±1.11c	73.27±3.15b	43.88±5.82c
甲醛	28.28±2.72b	74.95±1.42b	53.75±3.49d

　　注：1.同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)(n=6)
　　由表2可以看出，各保护剂处理组的蛋白降解率都显著低于对照组，不同保护剂对蛋白降解率的影响差异显著，其中戊糖-大豆粕蛋白降解率下降最为剧烈为15.72%，比对照组蛋白降解率73.04%低57.32个百分点，其次是甲醛，己醛糖、蔗糖、己酮糖。各处理组之间依次下降约10-20个百分点。可以看出不同糖对降低大豆粕蛋白降解率的效果差异较大。
　　各保护剂处理组的小肠可吸收蛋白均显著高于对照组(P<0.05)，这表明各保护剂处理均对蛋白有保护作用。其中保护效果最好的是戊糖，小肠可吸收蛋白是对照组的1.68倍，其次是甲醛、己醛糖，而己酮糖和蔗糖也有保护效果，但效果次之。
　　但值得注意的是，大豆粕经过戊糖处理在小肠消化率比较低，然而小肠可吸收蛋白(IADP)则比较高。
　　2.2.2不同保护剂处理对棉籽粕蛋白质的保护效果
　　表3 棉籽粕的瘤胃蛋白降解率(%)、小肠消化率(%)及小肠可吸收蛋白(%)
　　Table　3 RDP,ID and IADP of CM

	12h蛋白降解率(RDP)	小肠消化率(ID)	小肠可吸收蛋白(IADP)
对照	68.00± 3.43d	65.39±1.39c	20.92±3.26a
戊糖	52.85±6.20a	60.02±4.37b	28.30±3.72d
蔗糖	64.29±5.70c	58.26±5.19b	20.80±1.78a
己酮糖	63.81±6.57c	53.45±2.47a	19.34±2.46a
己醛糖	62.56±8.14c	64.65±1.22c	24.20±2.08b
甲醛	58.96±1.89b	65.25±0.96c	26.78±1.70c

　　注:同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)(n=6)
　　不同保护剂处理棉粕的效果见表3，可以看出各保护剂处理均使棉籽粕的蛋白降解率显著低于对照组(P<0.05)，其各处理组与对照组的差异没有同等条件下对大豆粕的影响显著。其中和大豆粕相同的是：戊糖处理组的蛋白降解率最低，其次为甲醛处理组及己醛糖、己酮糖、蔗糖处理组。从小肠消化率来看，保护处理对棉籽粕的小肠消化率有很大的影响，己酮糖、蔗糖、戊糖处理使棉籽粕小肠消化率降低。各保护剂处理组的小肠可吸收蛋白差异不大，都在20-30%之间;戊糖组小肠可吸收蛋白最高为28.3%，比对照组提高了38%，而己酮糖、蔗糖处理可以使棉籽粕有更多的UIP到达小肠但因为其在小肠的消化率降低而使在小肠中的可吸收蛋白没有增加，没有保护作用。
　　2.2.3不同保护剂处理对菜籽粕蛋白质保护效果
　　表4菜籽粕的12h瘤胃蛋白降解率(%)、小肠消化率(%)及小肠可吸收蛋白(%)
　　Table4 RDP,ID and IADP of RM

	12h蛋白降解率(RDP)	小肠消化率(ID)	小肠可吸收蛋白(IADP)
对照	71.90 ± 3.47e	69.55±0.30c	19.54±1.96a
戊糖	28.93±1.70a	65.52±1.07b	46.56±1.11f
蔗糖	55.16±3.23c	68.56±1.32c	30.74±2.22d
己酮糖	63.22±4.74d	60.93±1.19a	22.41±2.89b
己醛糖	56.18±5.93c	62.13±4.40a	27.22±3.69c
甲醛	46.50±0.59b	68.95±1.42c	37.18±0.41e

　　注:同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)(n=6)
　　菜籽粕中各保护剂处理组的12h瘤胃蛋白降解率均显著降低了对照组(P<0.05)，其中降幅最大的是戊糖处理组(见表4)。各保护剂处理组的小肠消化率，己酮糖、己醛糖和戊糖组显著低于对照组，形成了过保护。戊糖的小肠可吸收蛋白最高，其次是甲醛、蔗糖、己醛糖、己酮糖，分别是对照组的2.38，1.90，1.57，1.39、1.14倍，保护效果显著(P<0.05)。
　　2.2.4不同保护剂处理对花生粕蛋白质保护效果
　　表5花生粕瘤胃蛋白降解率(%)、小肠消化率(%)及小肠可吸收蛋白(%)
　　Table5 RDP,ID and IADP of PM

	12h蛋白降解率(RDP)	小肠消化率(ID)	小肠可吸收蛋白(IADP)
对照	44.53±5.53d	86.73±2.74b	48.11±4.67a
戊糖	25.57±1.45a	86.55±0.55b	64.42±1.28d
蔗糖	45.35±2.39d	85.11±2.32ab	46.51±2.04a
己酮糖	43.54±5.54d	84.92±4.83ab	47.55±4.80a
己醛糖	31.44±7.55b	86.07±0.35ab	59.01±6.50c
甲醛	38.85±5.69c	83.40±0.96a	51.00±4.75b

　　注:同列相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)(n=6)
　　如表5，蔗糖、己酮糖处理花生粕的瘤胃蛋白降解率与对照组差异不显著(P>0.05)，没有提供更多的UIP到达小肠，所以在此试验条件下蔗糖、己酮糖组对花生粕没有蛋白保护作用，而戊糖、己醛糖、甲醛处理组瘤胃降解率显著低于对照组(P<0.05)。各保护处理对小肠消化率没不良影响(甲醛处理除外)。戊糖、己醛糖、甲醛处理组的小肠的可吸收蛋白均显著高于对照组，具有保护作用。
　　3. 讨论：
　　3.1醣类对蛋白饲料保护效果的影响
　　醣的种类：美拉德反应是糖的羰基和氨基酸的氨基之间发生的反应，糖是参与反应的主要物质也是影响美拉德反应的主要因素，研究表明：五碳糖褐变速度是六碳糖的10倍，还原性单糖中五碳糖比六碳糖更容易反应;单糖比双糖较容易反应。这与本试验中保护效果戊糖>己醛糖的结论相一致。Cleale(1987) [4]用戊糖、己醛糖、己酮糖按1、3、5mol/mol大豆粕赖氨酸的比例150℃加热30、60、90min后的研究结果表明：随着糖浓度的增加，瘤胃蛋白降解率直线下降，戊糖是反应最活跃的糖。戊糖处理组瘤胃氨释放最低，依次是己醛糖、己酮糖，这与本试验的结论一致。
　　K. Stanford (1995) [5]用木质磺化盐(95℃加热1小时)保护大豆粕、棉籽粕，结果表明，戊糖保护处理显著的降低了大豆粕、棉籽粕的瘤胃降解率。K. A. Beauchemin (1995)[6]用5%木质磺化素保护棉籽粕，100℃加热1小时，测得(尼龙袋法)瘤胃降解率为26.7%，显著低于对照组的55.1%。Harstad(2000)[7]均发现木质磺化盐和甲醛处理对大豆粕蛋白的小肠消化率没有影响。这些都与本试验的数据相似。
　　表2表明，用戊糖处理的大豆粕在瘤胃的降解率明显低于其他处理(P<0.05)，而在小肠的消化率也是最低，可能的原因是本试验选用的反应条件使大豆粕蛋白质的氨基酸残基和戊糖的羰基化合物之间发生了过多的美拉德，导致反应形成了不容易被小肠酶分解的产物，从而使小肠消化率较低。
　　醣类的添加量：A.Can(2002)[8]用己醛糖作为非酶褐变剂保护对大豆粕进行保护处理加热30和60min，进行瘤胃降解率的研究，结果发现添加6%己醛糖水平处理组2h、16h、24h、48h的蛋白质降解率比0%己醛糖的降低，即提高己醛糖水平增加了UIP%。这证明一定条件下的添加一定的己醛糖对于大豆粕蛋白在瘤胃中的降解有保护作用，本试验中醣类的添加量为3%，所得出的结果基本和所报道的试验结论一致。
　　3.2不同的蛋白质饲料对保护效果的影响
　　美拉德反应(Maillard reaction)是氨基化合物(如胺、氨基酸、蛋白质等)和羰基化合物(如还原糖、脂质以及由此而来的醛、酮、多酚、抗坏血酸、类固醇等)之间发生的非酶反应，也称为羰氨反应，所以提供氨基化合物的蛋白质饲料特性及其与还原糖的比例也是影响美拉德反应的主要因素。KariLjkΦjel(2003)[9]用5mol己醛糖/mol大豆粕赖氨酸保护大麦和豌豆，100、125、150℃加热5、15、30min加热，结果表明：添加己醛糖对大麦中瘤胃蛋白降解率没有影响，但使豌豆的降低。这可能是大麦中还原糖的量和其他碳水化合物的还原残片可能足够与游离赖氨酸残基连接，相反，豌豆中碳水化合物：蛋白比例较低，其赖氨酸：蛋白也较大麦高，所以添加己醛糖促进了美拉德反应的进行，使豌豆的瘤胃蛋白降解率下降。另外，在美拉德反应中，含ε-氨基的氨基酸最易起反应，碱性氨基酸其次，在所有的氨基酸中，富含赖氨酸的食品易于产生褐变反应。基于以上原因，可以解释本试验中，相同的保护条件下，己酮糖使豆粕、棉籽粕、菜籽粕瘤胃蛋白降解率下降(P<0.05)，却对花生粕的瘤胃降解率没有影响(P>0.05);以及戊糖处理对豆粕的瘤胃蛋白降解率下降较为显著，而对棉粕的蛋白降解率影响相对较小的原因。
　　采用美拉德反应原理对粕类蛋白保护是一种全新的方法，虽然本试验中不同糖对大豆粕等粕类蛋白具有一定的保护作用，但是因为试验条件的限制，对温度、加热时间及保护剂条件还需要进一步的筛选才能获得更为理想的结果。还需要对其中的更多因素展开试验研究，方能取得最佳的保护效果，为实际应用提供参考。
　　4.结论：
　　在本试验条件下，戊糖、甲醛、己醛糖、蔗糖、己酮糖加热保护处理对大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕都具有一定的保护作用：不同糖的保护效果因粕类的不同而各有差异，其中戊糖的保护效果最为理想，经过戊糖处理的蛋白质饲料的小肠可吸收蛋白IADP最高;大豆粕对不同保护剂处理较为敏感，其他蛋白质饲料依次为菜粕、棉籽粕和花生粕。
　　参考文献：
　　1. 杨威.戊糖对粕类蛋白的保护作用及其对奶牛生产性能的影响.中国农业科学院.硕士论文.2007
　　2. 冯仰廉.尼龙袋法评定饲料蛋白质降解率的建议方案[A]奶牛饲养标准和典型日粮配方[M].北京:农业出版社,1989
　　3. Calsamiglia, S., and M. D. Stern. A three-step in vitro procedure for estimating intestinal digestion of protein in ruminants. J. Anim. Sci. 1995,73:1459~1465.
　　4. Cleale,R.M.,Klopfenstein,T.J.,Britton,R.A.,Satterlee,L.D.,Lowry,S.R.,1987.Induced non-ezymatic browning of soybean meal.1.effect of factors controlling non-enzymatic browning on in vitro ammonia release.J.Anim.Sci.65,1312-1318.
　　5. K.Stanford,T.A.McAllister,Z.Xu,M.Pickard,andK.-J.Cheng.1995.comparison of lignosulfonate-treated canola meal and soybean meal as rumen undergradable protein supplement for lambs. Can.J.Anim.Sci. 75:371-377.
　　6. K.A.Beauchemin,D.R.C.Bailey,T.A.McAllister, andK.-J.Cheng.1995.lignosulfnate-treated canola meal for nursing beef calves. Can.J.Anim.Sci. 75:559-565.
　　7. Harstad,E.Prestl&Oslash;kken. 2000. Effective rumen degradability and intestinal indigestibility of individual amino acids in solvent-extracted soybean meal (SBM) and xylose-treated SBM (SoyPass&reg;) determined in situ. Amimal feed science and technology. 83:31-47.
　　8. A.Can,A.Yilmaz. 2002.Usage of xylose or glucose as non-enzymatic browning agent gor reducing ruminal protein degradation of soybean meal.Small ruminant research. 46:173-178.
　　9. Kari Lj&Oslash;kjel, Odd Harstad, Egil Prestlùkken,Anders Skrede..2003.in situ digestibility of protein in barley (Hordeum vulgare)and peas (Pisum sativum L.)in dairy cows:influence of heat treatment and glucose addition. Animal Feed Science and Technology.107,87-104

作者：杨威，女，硕士，２００７年毕业于中国农科院饲料所

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