甘露寡糖和螯合锌对断奶仔猪生产性能、肠道微生物

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　　甘露寡糖和螯合锌对断奶仔猪生产性能、肠道微生物

　　和肠道组织形态的影响

　　M.Castillo(著);付建福1(译)

　　摘要：在日粮中添加甘露寡糖、有机锌及其它们的混合物可以提高断奶仔猪的生产性能、胃肠道的健康和免疫力。选择128头20±2d日龄的断奶仔猪，随机分为4个处理，每个处理8个重复，每个重复4头。日粮分别为基础日粮+0(CT组),0.2%的甘露寡糖(BM组)，80mg/Kg的锌(锌来源于有机锌)(BP组)和两者的混合物(BMP组)。试验期为5周，分为前期(0-2周)和后期(3-5周)。两周过后，32头仔猪屠宰，收集胃、回肠和盲肠的内容物，用这些样品测定其PH和短链脂肪酸，用定量PCR来测量细菌总数、乳酸菌菌落数，并测量空肠的组织形态、血清中免疫球蛋白的浓度和回肠的内容物的IgA水平。结果表明：试验组与对照组相比，提高了前期断奶仔猪的G：F(CT组，BM组，BP组，BMP组分别为0.63，0.69，0.67和0.68， P<0.04)。BM组和BP组与对照组相比，减少了断奶仔猪第21d腹泻指数(CT组，BM组，BP组和BMP组，分别为1.22，0.89，0.87和1.06， P=0.002). BM组中断奶仔猪减少了空肠的细菌总数(CT组，BM组，BP组，BMP组分别为9.13，8.05，8.87和7.89， P=0.05)。试验组中回肠重量与对照组相比，呈增加趋势，特别是BP组(CT组，BM组，BP组，BMP组分别为8.9，9.6，11.9和10.3g/Kg)。BPM组与对照组相比，显著的降低了隐窝深度(281：235;P<0.03)。内容物的PH、短链脂肪酸浓度和血清中的免疫球蛋白浓度，试验组与对照组无显著性差异。结论：甘露寡糖和有机锌可以提高断奶仔猪的生产效率。
　　关键词：BioMos，甘露寡糖，螯合锌，生产性能，有机锌，腹泻
　　1.前言
　　减轻早期断奶仔猪腹泻是当今养猪业的主要挑战之一。在生产实践中，添加一些物质可以减轻仔猪断奶产生的应急。其中具有代表性的就是甘露寡糖(MOS)和Zn，大量试验表明，它们对断奶仔猪的健康具有积极作用。Bio-Mos(葡萄糖甘露寡糖)是甘露寡糖一种，主要来源于酵母细胞壁提取物(Miguel等，2004)。研究表明，BioMos主要通过上皮细胞阻止细菌的生长(Spring，2000)和提高动物的免疫力(Newman等，2001;Quinn等，2001)。ZnO到达药理学浓度(2000-3000mg/Kg)可以减少断奶仔猪的腹泻(Poulsen，1995)和提高断奶仔猪的生产性能，但是作用机理尚未清楚。Zn对机体有作用(Case和Carlson，2002)。Davis等(2002)报道，高剂量的ZnO和BioMos可能具有正协同作用。然而，使用高剂量的无机锌饲喂超过10d，才对动物有作用。有机锌的生物学效价更高，仔猪得到同样的生产性能，可以减少日粮中Zn的添加量和减少Zn的排放。
　　本试验主要研究BioMos、有机锌(螯合锌)或两者的混合物对断奶仔猪生产性能、胃肠道健康和免疫力的影响。
　　2.材料与方法
　　2.1试验动物和日粮
　　选择128头18-22日龄，平均体重为6.7±1.17Kg的断奶仔猪(皮特兰×长×大，66公猪和62猪。试验分为4个处理，每个处理8个重复，每个重复4头仔猪。它们分别饲喂在32个栏中，记录仔猪初始重。基础日粮根据NRC(1998)的要求，适当的调整。个处理组的日粮分别为基础日粮(见表1)+0(CT组),0.2%的甘露寡糖(BM组)，80mg/Kg的锌(锌来源于有机锌)(BP组)和两者的混合物(BMP组)。日粮中没有其他的药物添加剂。试验期为5周，分为前期(0-2周)和后期(3-5周)。断奶仔猪可以自由采食和饮水。
　　表1：前后期基础日粮的组成及其营养水平

项目	试验期
	前期	正式期
成分，g/Kg
膨化玉米	360.6	180.0
大麦	-	215.7
小麦	-	100.0
膨化小麦	240.2	120.0
豆粕，44%CP		93.0
豆油	40.0	93.0
大豆浓缩蛋白	60.0	60.0
麦麸	60.0
马铃薯蛋白	30.0
含脂乳清粉	30.0	30.0
乳清粉	150.0	80.0
碳酸钙		7.0
磷酸钙	16.0	9.0
食盐		2.0
L-Lys-HCl,99%	5.0	3.0
DL-Met,99%	0.3	0.9
L-Thr,98%	0.7	0.7
L-Trp,98%	0.2
VB混合物	2.0	0.7
维生素和矿物质预混料添加剂	5.0	5.0
化学组成
CP，%	21.6	18.9
粗纤维，%	4.97	3.99
粗脂肪，%	3.58	4.14
灰分，%	4.9	4.9

　　2.2取样
　　每周记录仔猪的体重和饲料消耗和计算ADFI，ADG和G：F。前3周记录粪便的评分。粪便的评分分为0-3，0分表示正常条形或粒状，1分表示软粪，能成形，2分表示稠状，不成形，粪水无分离现象，3分表示液状，不成形，粪水无分离现象。在14d，每个重复中的1头仔猪，选择体重接近的仔猪屠宰。屠宰前前腔静脉采血用来测量血液中免疫球蛋白的浓度。记录小肠的重量和回肠的重量。收集胃肠道的食糜用来测量它们的PH。样品收集5g左右，迅速放在-20℃冰冻起来，用来分析短链脂肪酸的浓度。回肠、盲肠、直肠的食糜也在-20℃冰冻和冻干，用来分析嘌呤。取接近1g的空肠食糜并放在酒精中，为了DNA提取和以后的微生物的研究(Castillo等，2006)。
　　2.3方法
　　2.3.1短链脂肪酸测定方法
　　分析短链脂肪酸用的是GLC方法，此方法用在Jensen等(1995)改进Richardson等(1989)试验的方法。
　　2.3.2嘌呤测定方法
　　嘌呤浓度(腺嘌呤和鸟嘌呤)在冻干的食糜(40mg)用HPLC(Makkar和Becker，1999)测量。食糜加入2ml的2M HClO4后在100℃孵化1h， 再加入0.5μl的1mM别嘌呤醇，核酸分子经过一系列的水解得到嘌呤。
　　2.3.3免疫球蛋白的测定方法
　　用ELISA间接法测量血清中的IgG、IgA、IgM的浓度。每个血样在2000转离心15min，上清液就是血清。测定IgA是用Swanson等(2002)测定的方法，用2g的样品去干和用研钵磨碎，然后倒入Erlenmeyer瓶中，加入20ml的PBS溶液，调整PH到7.2.样品在30min的室温混合，在2000转离心30min.，上清液收集。回肠中的食糜的CP用Kjeldahl方法测定(AOAC，1990)，作为总的N含量，计算出回肠食糜的IgA浓度
　　2.3.4 DNA的提取
　　取400mg的食糜保存在3ml，96%的酒精中，用13000转离心5min。DNA来自于沉淀物提取，净化剂用商业的QIAamp DNAStool MiniKit(Qiagen，UK)，推荐的变性温度增加到90℃，和延伸时加入溶解酵素增加细菌细胞的复制。在200μL的Qiagen Buffer AEDNA的洗提DNA和保存在-80℃.
　　2.3.5定量PCR
　　空肠总细菌和乳酸菌的测定。空肠中的食糜用SyBR绿色化学试剂，即时用PCR。过程和Castillo等(2006)测定的过程一样。
　　2.3.6组织形态的测定方法
　　用福尔马林浸泡的样品，石蜡包埋和切片并染色。用显微镜观察测量每个样品的绒毛长度和隐窝深度。绒毛长度和隐窝深度都用平均值表示。绒毛高度是隐窝的开口到绒毛顶部。隐窝深度是从隐窝基地部到隐窝开口的水平距离。计算绒毛长度：隐窝深度。
　　表2：断奶仔猪初始末体重，ADG，ADFI，G：F

项目	日粮				SEM	P值
	CT	BM	BP	BMP
体重，Kg
开始	6.65	6.64	6.63	6.68	0.434	0.99
结束	17.71	17.80	18.00	18.56	1.025	0.94
ADFI，Kg
前期	0.24	0.22	0.24	0.24	0.011	0.58
后期	0.68	0.64	0.66	0.69	0.042	0.82
全期	0.50	0.47	0.49	0.51	0.023	0.54
ADG,Kg
前期	0.15	0.14	0.15	0.16	0.032	0.77
后期	0.43	0.44	0.44	0.47	0.039	0.72
全期	0.32	0.32	0.32	0.34	0.016	0.71
G：F，Kg/Kg
前期	0.62	0.63	0.61	0.66	0.052	0.88
后期	0.63b	0.69a	0.67a	0.68a	0.014	0.04
全期	0.63b	0.68a	0.65ab	0.67a	0.009	0.03

　　注：列行上标字母相同者表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)
　　日粮CT为对照组，日粮BM为添加0.2%BioMos的日粮，BP为80mg/Kg的Zn的日粮，BMP为BioMos和Zn的混合添加的日粮。
　　前期：断奶后0-2周;后期：断奶后2-5周;前期：断奶后0-5周
　　2.4数据分析
　　所有的数据使用分析软件SAS的普通线性模型(GLM)进行差异性分析。
　　3.结果
　　3.1生产性能
　　BW、ADG、ADFI和G：F的结果见表2. 在各处理组的平均日增重和ADFI无显著性差异(P>0.71)。在试验后期，断奶仔猪日粮中添加了BioMos和螯合锌显著的提高仔猪的G：F(P=0.04)。在整个试验中仔猪饲喂BM和BMP显著的提高了仔猪的G：F(P<0.05).
　　3.2腹泻指数
　　在头3周的断奶仔猪的粪便评分。各处理组的粪便在0-4d都不成形(P=0.001)。在7d期间，BM组和BP组与对照组相比，降低了粪便的评分。但是，BMP组对粪便评分无影响(对照组，BM，BP和BMP组分别为1.43，0.38，0.71和1.63; P=0.02)。在整个试验期，BM和BP组与对照组相比，粪便的评分有所增加(对照组，BM，BP和BMP组分别为1.22，0.89，0.87和1.06;P=0.002).
　　3.3肠的重量和长度
　　试验日粮对所有的肠道重量和长度无影响。然而，回肠的重量呈增加的趋势(P=0.08)(对照组，BM，BP和BMP组分别为8.91，9.56，11.92和10.34g).
　　3.4短链脂肪酸
　　日粮对断奶仔猪的肠道中的内容物PH无影响(胃、回肠、盲肠的PH分别为3.2±0.29，6.7±和5.7±0.14)短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，不同的日粮对短链脂肪酸无影响(胃、回肠、盲肠的短链脂肪酸的总量分别为7.9±1.05，12.5±2.01和134.4±7.49μmol/g)。短链脂肪酸的总量在各处理组中的含量都一样(胃、回肠、盲肠的短链脂肪酸的总量分别为4.1±0.59，13.6±3.85和3.7±1.65μmol/g).
　　3.5细菌数量
　　回肠、盲肠和直肠中的内容物的嘌呤浓度，作为细菌数量和活性的估算。结果见表3. 从回肠到盲肠，增加嘌呤的浓度，但是各处理组无显著性差异(P≥0.19)(回肠、盲肠、直肠分别为6.46，47.65和35.04μmol/g).
　　表3：断奶后14d，回肠、盲肠和直肠中的食糜中含嘌呤浓度(μmol/g)和乳酸菌、
　　细菌总数数量及其它们的比值

项目	日粮				SEM	P值
	CT	BM	BP	BMP
嘌呤浓度
回肠	6.17	5.62	6.58	7.46	1.38	0.81
盲肠	50.23	40.38	52.86	47.16	5.64	0.45
直肠	41.28	25.28	34.79	40.00	6.25	0.19
细菌数
乳酸菌	10.04	9.62	9.76	9.79	0.27	0.75
细菌总数	9.13a	8.05b	8.87ab	7.89b	0.28	0.01
L：E	0.91b	1.57ab	0.89b	1.89a	0.29	0.04

　　注：列行上标字母相同者表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)
　　日粮CT为对照组，日粮BM为添加0.2%BioMos的日粮，BP为80mg/Kg的Zn的日粮，BMP为BioMos和Zn的混合添加的日粮。
　　L：E表示乳酸菌与细菌总数的比值
　　各处理组空肠食糜中乳酸菌数量无显著性差异影响。但是BM和BMP组与对照组相比，减少了细菌总数(P<0.05).BMP组与对照组相比，提高了乳酸菌：细菌总数的比值(P=0.03)。
　　3.6免疫球蛋白和肠道形态
　　血清中的IgG、IgM和IgA浓度，回肠的IgA浓度和回肠的形态见表4.免疫球蛋白、回肠IgA、上皮淋巴细胞数量、在空肠杯状细胞数量，各处理组无显著性差异。然而，BMP组显著的降低了隐窝深度。(P<0.04). BMP组与其他的组相比，显著的提高绒毛长度：隐窝深度(P<0.05).
　　表4：断奶后14d，仔猪血清、回肠中免疫球蛋白的浓度和空肠的组织形态

项目	日粮				SEM	P值
	CP	BM	BP	BMP
血清
IgG	25.50	20.97	25.10	13.88	4.142	0.26
IgM	4.40	5.44	6.81	5.05	0.853	0.32
IgA	0.82	1.43	1.48	1.05	0.255	0.34
回肠食糜g
IgA/DM	1.47	2.01	1.72	1.94	0.470	0.85
IgA/CP	6.19	8.29	7.04	7.42	1.670	0.84
空肠
C，μm	281.3a	241.60ab	240.10ab	234.50b	11.980	0.04
V，μm	338.5	340.80	328.50	335.10	19.420	0.97
V：C	1.23b	1.41ab	1.40ab	1.46a	0.060	0.05
L：E	4.64	3.60	4.66	5.16	0.940	0.69
CG：E	17.56	15.33	15.70	15.51	1.071	0.44
VG：E	3.36	3.35	3.83	2.91	0.604	0.76

　　注：列行上标字母相同者表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)
　　日粮CT为对照组，日粮BM为添加0.2%BioMos的日粮，BP为80mg/Kg的Zn的日粮，BMP为BioMos和Zn的混合添加的日粮。
　　C表示隐窝深度;V表示绒毛长度;L表示淋巴细胞数;CG表示隐窝杯子细胞;VG表示绒毛杯子细胞;E表示100个肠上皮细胞
　　4.讨论
　　大量研究表明甘露寡糖可以提高断奶仔猪的生产性能。(Dvorak和Jacques，1998;Davis等，2002，2004a)。目前，在断奶仔猪饲喂BioMos的54个不同的试验证实4.12%的试验说明提高ADG，2.11%的试验说明提高ADFI和2.29%说明的试验提高G：F(Miguel等，2004)。Carlson等(2004)报道，在断奶仔猪日粮中添加有机锌，不能提高动物的生产性能。然而，其他的试验证明，螯合锌可以提高青年猪的生产性能(Mullan等，2002，2004)。本试验中，甘露寡糖或螯合锌与对照组相比，提高了仔猪的G：F，可以提高动物前期的生产性能。我们不能证明甘露寡糖和螯合锌两者的混合可以提高动物的生产性能。Le Mieux等(2003)，在一系列的试验中，在仔猪日粮中添加甘露寡糖和ZnO得出相反的结论。
　　甘露寡糖通过改变胃肠道的微生物区系和减少肠道中的病原菌，来提高动物的生长(Newman，1994;Spring，2004)。在家禽中，甘露寡糖与病原菌在肠壁上的受体具有相似的结构，它与病原菌表面的类丁质也有很强的结合力，防止病原菌的繁殖(Spring，2003)。本研究表明，BM和BMP组与其它组相比，可以减少肠道中的细菌总数。同样的，White(2002)报道，猪饲喂甘露寡糖时，可以减少大肠杆菌数。减少细菌总数是非常有意义的，因为它们与仔猪发生腹泻具有相关性(Melin，2001)。乳酸菌：细菌总数的比值是衡量动物健康的常规指标(Muralidhara等，1977)，随着这个比值越大，对动物健康更有利(Ewing和Cole，1994)。约束细菌总数可以防止和减少断奶仔猪腹泻(Melin等，2004)。
　　肠道食糜没有反映细菌的数量的改变，日粮对它没有影响。在断奶仔猪日粮中添加MOS不能改变粪便中的PH和短链脂肪酸的浓度(White等，2002)。尽管非消化性寡糖被认为是短链脂肪酸的促进物(Kaplan和Hutkins，2000)，这些寡糖在其他未消化的碳水化合物占的比率比较小，比如非消化性淀粉或谷物类的非消化性多糖，大豆非消化性寡糖可能可以排除潜在的发酵促进物质。
　　Katouli等(1999)报道，ZnO增加肠道中微生物的稳定，通过减少大肠杆菌的多样性，但是对大肠杆菌总数没有影响。Jensen Waern等(1998)也报道对大肠杆菌数量没有影响，在断奶仔猪中添加2500mg/Kg的ZnO对埃希氏菌属和肠道球菌没有影响。缺乏药理学浓度的Zn直接对特殊细菌数量的影响的研究，这样就造成很难认为Zn(来源于有机锌)在低浓度的情况下，可能直接影响肠道微生物。
　　断奶仔猪挑战抗原、新的日粮并建立肠道微生物。在机体，仔猪利用母源IgA控制特殊的病原菌繁殖(Kelly和King，2001)。在断奶期间靠免疫体系来维护肠道的消化和吸收功能(Bailey等，2001)。断奶应急使仔猪肠道绒毛萎缩，增加隐窝细胞，从而降低绒毛长度：隐窝深度的比值(Miller等，1986)。
　　Ferket(2002)报道，添加0.1%BioMos，对绒毛长度无影响，但是降低了隐窝的深度和绒毛长度：隐窝深度的比值。Iji等(2001)也表明，在家禽中增加了绒毛长度：隐窝深度的比值，因为绒毛长度比隐窝深度增加的更多。BioMos对肠道形态的改变可能是由于减少了细菌总数，但是也可能是其它的原因。
　　Davis等(2004b)研究表明，在断奶仔猪中添加BioMos会改变白细胞数量。Swanson等(2002),表明在狗的日粮中添加MOS和果寡糖显著的提高IgA水平。Judoh等(1999)报道，在猫的日粮中添加MOS，可以提高排泄物的IgA水平。在机体中分泌的IgA抑制细菌抗原的表达和对粘膜的免疫性具有非常主要的作用。因为它可以抑制细菌和毒素的在机体的附殖。(McKay和Perdue，1993)。调节免疫系统预防突发性的免疫反应，可以提高动物的生产性能。在本试验没有免疫学参数发生变化，可能是免疫指标微薄的变化。
　　补充Zn对肠道形态和机体的影响，Li等(2001)报道，在猪中添加高剂量的Zn可以提高绒毛长度和降低隐窝深度。Carlson等(1999)研究表明，增加了断奶仔猪粘膜细胞对ZnO的反映，Zn的作用在RNA-DNA细胞增殖和MT的增殖的动态平衡中，增加了细胞的增殖和蛋白质合成。这样就可以解释增加了绒毛长度：隐窝深度的比值。同样的报道，Carlson和Poulsen92003)报道，在断奶仔猪日粮补充ZnO，增加粘膜的MT量。结果表明：在本试验中，血清中的免疫球蛋白浓度无显著的影响。动物饲喂有机锌显著的提高回肠的重量，这可能是发展免疫球蛋白的来源。
　　结论：BioMos和螯合锌提高前期断奶仔猪的G：F。BioMos减少空肠中细菌总数，和螯合锌增加回肠的重量(P=0.08)。添加BioMos和螯合锌两者的混合物显著增加了绒毛长度：隐窝深度的比值。

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