饲料活性赖氨酸的几种测定方法

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　　饲料活性赖氨酸的几种测定方法[1]

　　邓敦  谢冰梅 唐时花  邓跃林

　

　　赖氨酸(lysine, Lys)作为猪的第一限制性氨基酸，从20世纪50年代开始一直是动物营养学研究的热点之一。Lys在动物饲料中用量大、成本较高，因此必须精确地确定动物最佳生长发育的最低需要量。另一方面许多原料经过加热、加压、磨粉、碱处理或贮存时间过长，均可导致Lys的є-氨基与其它物质发生反应，形成脱氧酮糖化合物，该物质虽能被动物吸收，但无营养价值(Eichner 等, 1994)，从而导致部分Lys不能被动物利用。只有准确评价Lys的有效率，才能合理利用Lys，从而避免蛋白质资源的缺乏和浪费，减少动物对氮的排放和环境污染。准确测定饲料和回肠末端食糜活性Lys含量，将有利于动物对Lys需要量的研究。
　　1 活性Lys(Reactive lysine)的定义
　　Lys的基本结构为丙胺酸(如图1)，丙胺酸的β-碳原子上带有一个丙胺基，ε-氨基比α-氨基具有较高的pKa(多肽为10.5)，从而使得Lys侧链的亲核性下降。特殊环境作用能够降低Lys侧链的pKa，使之变得活跃。活性Lys是指Lys上的є-氨基能与其他物质发生反应的Lys，可利用Lys是指食入的Lys能够被动物吸收并可用于蛋白质合成的Lys，可消化氨基酸是指食入的Lys经消化后被吸收的Lys，从实用角度，可以把可消化Lys和可利用Lys同等对待，但活性Lys与可消化Lys或可利用Lys有着本质的区别。
　　图1 赖氨酸的基本结构
　　2 活性Lys的测定方法
　　饲料活性Lys的测定方法有多种，每一种方法都有各自的优缺点，许多研究者对各种方法分别进行了论述(见表1)。
　　2.1 1-F-2，4-二硝基苯法(FDNB法)
　　Carpenter(1960)用FDNB法连接Lys残基，酸水解之后用分光光度计测定DNP-Lys含量，当样品含有碳水化合物时，会生成一些不稳定的化合物，导致过高估计活性Lys含量(Matheson，1968)。Holm(1971)在碳水化合物水解时，试图使用色谱法从受到干涉的氨基酸和其他化合物中分离出DNP-Lys。Peterson和Warthesen(1979]使用高效液相色谱来分析活性Lys，检测波长为436 nm，C18毛细柱，20%乙氰和80% 0.01M醋酸盐缓冲液(pH 4.0)作为流动相，该法首先应用在分析二硝基苯基化棉籽蛋白的水解产物。Catherine等(1997)[11]应用上述方法未能很好地测定DNP-Lys，并得出DNP-Lys紫外线最大吸收峰在364 nm，而不是在436 nm，并对此分析方法做了改进，用20%乙氰和80%0.01M邻苯二甲酸氢钾缓冲剂(pH3.9)混合物作为流动相，在此条件下，DNP-Lys和其它化合物能很好地得到分离。Qin等(1998)报道，用FDNB法测定中国大豆和阿根廷大豆活性Lys，加热到100℃和118 ℃时，FDNB-活性Lys变化规律不明显，但当加热到136℃，两种大豆中活性Lys含量随加热时间的延长而降低。近年来，很多学者用高效液相色谱法测定以谷物为主的婴儿食物、婴儿配方食品和其他食品DNP-Lys含量，但是没有进一步与动物试验结果进行比较(castillo等，1997;Alala-Hurtado等，1999;Fernandez-Artigas等1999;Hermandez等，2001)。
　　表1饲料原料活性赖氨酸的测定方法

方法	出处
1-F-2，4-二硝基苯法（FDNB）	Carpenter，1960
胍基反应法 (Guanidination)	Mauron 和 Bujard，1964
O-邻苯二甲醛(OPA)	Goodno等，1981
化学计量染色法	Ibolya 和Margit，1985

　　2.2 胍基反应法 (Guanidination)
　　胍基反应法是Mauron和Bujard(1964)建立一种活性Lys分析方法，这种方法根据ε-氨基在碱性条件下与邻-甲基脲胍基反应形成同型精氨酸，经过水解后同型精氨酸可以用离子交换层析法测定，该测定方法尽管反应时间较长(几天)、温度控制严格(室温)，但分析结果可靠，因此现在还普遍使用。Mao等(1993)用葡萄糖或碱处理大豆活性Lys，结果表明，与总Lys分析比较，葡萄糖处理组总Lys含量下降17%~40%，活性Lys含量下降78%~85%。用胍基反应证实了热碱处理损害活性Lys更为真实, 其原因是在酸水解时重新除去一些被反应的Lys(如美拉德反应起始物果糖-Lys)。Imbeah 等(1996)在酪蛋白和大豆粉中得到胍基反应的最佳反应条件，得到可溶奶蛋白Lys转化率为100%，大豆稍低于80%。 Ravindran(1996)等研究了饲料原料胍基反应，以确定内源氨基酸的分泌量，主要集中棉籽蛋白最佳转化的研究，64% Lys转化为同型精氨酸。Moughan(1996) 在上述相同的试验条件下，用胍基反应法与FDNB法测定了热处理酪蛋白/乳糖混合物中活性Lys含量;Rutherfurd(1997 a)用胍基反应法和FDNB法对血粉、小麦粉、肉骨粉、豆粉、棉子粉活性Lys含量进行比较。两者结果表明，胍基反应法测出活性Lys含量等于或高于用FDNB法(见表2)。因此，Rutherfurd(1997a, b)、Moughan(1996)指出该方法在消化试验中能更加精确地确定Lys消化率，因为在分析粗原料和食糜Lys时，没有减去蛋白质水解前所破坏的Lys。从表3可见，在血粉、豆粉、肉骨粉、干燥玉米、热脱脂乳粉以及棉籽粕中，常规氨基酸分析法测定回肠真消化率明显低于可消化Lys含量。
　　表2胍基反应法和FDNB法测定蛋白质原料活性赖氨酸含量的比较

饲料原料	FDNB法	胍基反应法
血粉	84.4	88.0
小麦粉	3.1	3.1
肉骨粉	30.4	34.6
豆粉	27.1	32.3
棉子粉	14.7	14.4

　　2.3 荧光计分析法(OPA法)
　　Goodno等 (1981)设计了一种荧光计分析法，用邻苯二甲醛(OPA)来估价蛋白质活性Lys。Vigo等(1992报道美拉德反应前后，不同富含碳水化合物奶产品，其活性Lys含量可用OPA分光光度计法进行测定(表4)，从FDNB法测得的数据可以看出，透析前活性Lys明显低于透析后，无透析样品损失了活性Lys，可能是由于糖含量较高。当有糖存在时，FDNB法测量活性Lys会过低。从OPA法测得的结果来看，透析与不透析的差异不明显。所以在有高水平糖存在时，用OPA法分析饲料或食物活性Lys应该是可行的。
　　表3几种饲料原料中“常规”回肠真消化赖氨酸与可消化“活性”赖氨酸的比较

饲料原料	赖氨酸消化率		标准误
	“常规”	可反应
血粉	96.3	96.7	0.41NS
小麦	92.6	92.1	0.45NS
肉骨粉	88.9	91.5	0.76NS
豆粕	94.5	96.5	0.41※
干燥玉米	80.5	84.3	1.54※
热脱脂乳粉	69.1	94.0	1.11※※※
棉籽粕	62.1	71.9	1.75※※

　　NS表示差异显著;※, P<0.01; ※※, P<0.05; ※※※, P<0.001(Rutherfurd 等，1997)。
　　表4 相同模式下OPA法和FDNB法测出透析和未透析奶制品赖氨酸值

	未透析样品			透析样品
	OPA	FDNB		OPA	FDNB
样品1	8.2±0.16	7.3±0.09		8.2±0.10	8.4±0.12
样品2	7.0±0.21	6.5±0.15		7.1±0.15	7.1±0.08
样品3	6.2±0.17	5.0±0.09		6.3±0.18	6. 1±0.05
样品4	4.6±0.11	4.0±0.04		4.5±0.03	4.6±0.03
巴氏法灭菌牛奶	8.9±0.19	6.9±0. 04		8.8±0.19	8.5±0.16
牛奶粉	8.0±0.09	6.5±0.07		8.0±0.1 5	7.7±0.04
浓缩甜牛奶粉	7.4±0.12	6.4±0.13		7.3 ±0.18	7.1±0.05

　　※样品1 未加热, 样品2 60°C加热20小时, 样品3 100°C加热1小时, 样品4 120°C加热45分钟; 表中数据为平均±标准差。
　　与其它化学方法比较，用OPA法估计奶产品活性Lys有以下几个优点：1)糖不会干涉;2)分析样品量少;3)操作简单;4)没有严格的处理，如蛋白质水解、加热或溶剂萃取，可以在短时间内完成。
　　2.4 化学计量染色法
　　Ibolya和Margit (1985)使用化学计量染色法确定大豆蛋白活性Lys含量，根据蛋白质自由碱性基团与1-苯-2萘酚-6, 8二磺酸(OG)反应来确定。蛋白质游离的部分碱性基团(组氨酸、精氨酸和Lys)来确定总氮含量，部分碱性基团通过美拉德反应来确定总氮变化。根据两个分子结构不同而作出的假设，OG颜色敏感性只有AO-12(十二烷基二甲基氧化铵)的一半。因为OG含氮载体能够结合两个氨基，而AO-12只能结合一个氨基。染料与蛋白质比通常小于1， AO-12测定活性Lys是直接根据它的染色能力。
　　染色法是测量蛋白质热反应最方便的方法，具有便宜、省时省力、不需要水解蛋白质等优点。3 小结
　　FDNB法、胍基反应法、荧光计分析法和化学计量染色法四种方法各有优缺点。在实际生产中，为了检测活性Lys的结果更加准确，应根据不同饲料原料选择不同的方法。通过测定饲料和回肠食糜活性Lys含量，我们能够精确估计饲料成本，更有效地选择饲料原料，从而为配制高效日粮提供理论依据，进一步改善日粮蛋白质的利用效率，为节约蛋白质资源开辟新的道路。
　　参考文献
　　1 Swaisgood, HE and Catignani, GL. Digestibility of modified milk proteins: nutritional implications. J. Dairy Sci. 1985, 68, 2782-90.
　　2 Carpenter, KJ.. The estimation of the available lysine in animal protein foods. J. Biochem. 1960, 77, 604-10.
　

quickl

一直要找的资料。。。收藏了。谢谢楼主

jstcxzh

没看明白，测活性赖氨酸的作用和实际指导意义。谢谢!