豆粕发酵过程参数与检测方法的建立

叶赫娜兰.孤城

以前的一篇论文，直接上了，和大家分享。

欢迎讨论，欢迎批评。

因为是强调“参数选取”，所以，试验并没有更多的罗列。

希望这个思路会对搞发酵的同行有所触动。

叶赫娜兰.孤城

摘要：考虑到经典液体发酵40%左右的动力费用为发酵豆粕的附加值所不能接受，又加上围绕原料展开工艺和由于没有明确，单一产物所允许的较大的工艺弹性，豆粕发酵可以采用固体发酵工艺。

固体发酵工艺是在成本压力和以原料处理为目的允许下采取的次于液体发酵工艺的工艺路线，为此，带来的是工艺可控性的降低。

鉴于这种局面，既然已经选用固体发酵工艺，则，出于对加强工艺稳定性的考虑，使用好氧发酵，在短时间内结束发酵工艺，以缩短时间的方法，减少工艺风险，把发酵风险控制在工艺及成本许可之内，就成了首选。

现在的豆粕发酵，不应该继续农业发酵或食品发酵的工艺路线，现在的豆粕发酵没有得到，也不可能有时间得到几百年的经验积累。而液体深层发酵，却在近百年的发展中积累了大量的技术经验，包括检测方法，数据分析，控制反馈，甚至设备选型，物料平衡等等。第一步，先实现稳定的固体发酵工艺，参照液体深层发酵建立固体发酵过程参数，是必然的选择。

事实证明选取的过程参数在描绘和控制发酵过程上是有效的。在建立了有效地检测/监测机制后，发酵豆粕乃至整个固体发酵工艺，将摆脱不能控制的局面，而大幅度提高工艺稳定性。

叶赫娜兰.孤城 于 2010-6-18 17:39 补充以下内容

关键词：豆粕发酵；工艺稳定性；检测-反馈；固体发酵生理参数

叶赫娜兰.孤城

1.        豆粕发酵的意义

一方面由于因为鱼粉等高端蛋白饲料价格的提升，深加工豆粕作为一种鱼粉的替代品而被开发。另一方面，作为一种常见的大宗原料，深加工是原料提高综合效益的有效方法。

对于豆粕的处理，主要集中在酶解，发酵等生物方法中。相对于酶解只是简单的对蛋白进行切割，发酵是在酶解蛋白的同时，利用微生物的代谢产生大量的活性物质或成味物质。因此具有单纯酶解所起不到的作用。

对此业内已经形成统一的认识，即发酵是目前最有力的豆粕处理方法。

2.        豆粕发酵工艺选择与目前存在的问题

豆粕发酵，目前达成共识的是使用固体发酵工艺，在此基础上，又有厌氧与好氧之别。往往是出于对代谢效率的追求或稳定性的强调而选用好氧工艺，而出于对较高的得率的追求或低成本的强调而选用厌氧工艺。

出于商业运作的缘故，海外厂家对自己的发酵工艺持保密态度，如：丹麦的哈姆雷特公司的HP300和HP400，美国ADM公司的Soycomil K,台湾的惠胜实业公司生产的“比多福”等。

可以推测，只要是在饲料中应用的大宗原料，就不会是应用液体发酵工艺。但是，相对于液体深层发酵工艺，固体发酵工艺（尤其是国内的固体发酵工艺），却普遍存在产品着稳定性差，过程难以控制或根本没有过程控制的现状。严重制约发酵豆粕工艺的开发与应用。

没有稳定的产品就没有所谓产品的比较，没有稳定的可重复的生产过程，就谈不上稳定的产品。所以，相对于出于对发酵效果的强调，而进行的菌株选用的争论，发酵过程的稳定性，是目前的尖锐问题。

叶赫娜兰.孤城

固体发酵工艺的选取

所有的生化反应，都是在水环境（或称水溶液）中进行，水活度是保证代谢效率的最重要因素。出于效率的考虑，一般大工业发酵工艺，如抗生素，氨基酸，有机酸，优先选用液体深层发酵工艺。使得液体深层发酵工艺得到了大量的技术积累。由于发酵是一个结合微生物学与化工合成，机械制造的跨行业，跨学科的系统工程，原有的技术积累也加强了工程人员进行工艺路线选取时对液体深层发酵工艺的倾向。只有当液体深层发酵工艺不能得到产物或副产物太多且有毒的情况下，才会考虑使用固体工艺。

但相对于一般经典发酵“单一菌种，单一产物”的模式，豆粕发酵有它的特殊性，即：

1，没有明确的，单一的产物。
2，附加值相对抗生素等经典发酵要低的多。
3，是以大宗原料处理，即围绕原料为中心展开的工艺，而不是围绕产物为中心展开的工艺。

这样，考虑到经典液体发酵40%左右的动力费用为发酵豆粕的附加值所不能接受，又加上围绕原料展开工艺和由于没有明确，单一产物所允许的较大的工艺弹性，豆粕发酵可以采用固体发酵工艺。

固体发酵工艺是在成本压力和以原料处理为目的允许下采取的次于液体发酵工艺的工艺路线，为此，带来的是工艺可控性的降低。

鉴于这种局面，既然已经选用固体发酵工艺，则，出于对加强工艺稳定性的考虑，使用好氧发酵，在短时间内结束发酵工艺，以缩短时间的方法，减少工艺风险，把发酵风险控制在工艺及成本许可之内，就成了首选。

当然，也可以应用厌氧发酵，来得到较高的收率，就需要较长的时间。这样有可能使工艺的发酵风险成本增高，是否合理，有待考察。

但是，不管是厌氧发酵还是好氧发酵，出于工艺稳定性考虑，对发酵过程实行全程可控，是固体发酵工艺必须要解决的问题。

叶赫娜兰.孤城

固体发酵工艺没有提供可供过程控制的过程参数

发酵工艺的第一品质是稳定性，稳定性是工业化的保证。而工艺稳定性的外在表现，是可重复性。作为大宗原料的处理，豆粕发酵对稳定性的要求是相当高的。作为发酵工艺，稳定性或可重复性的实现，是通过全程可控来实现的。也即，全程在均匀时间点取样，检测生理参数，回馈发酵控制，以实现发酵过程。没有监测的发酵过程是不可想象的，液体深层发酵对此积累了大量的经验，包括检测方法及数据处理。

但是，固体发酵工艺并没有相应的丰富的检测/监测数据，更谈不到数据处理技术的经验性积累。

2.2.1历史渊源与技术积累

产生这种状况的原因在于固体发酵的渊源。

目前的固体发酵工艺，起源于两个源流，一个是传统农业中食用菌栽培与微生物纯培养技术的结合，一个是食品发酵工业中白酒，啤酒，酱油的古典发酵技术。

也就是说，与经典发酵的液体深层培养技术不同，固体发酵，并不是以化工为前身，用化工合成工程思想与技术去结合微生物理论而得到工艺，也不是把液体深层发酵技术中的液体培养基“固体化”，而是起源于农业和食品业。这样，一般的固体发酵没有借鉴化工合成的单元操作，过程控制与检测等等思想与技术。也没有相应的技术积累。

农业微生物技术和食品发酵工程是积累了几百，甚至上千年经验的，以经验模糊控制的工艺过程。是一个复杂体系。而目前的豆粕发酵却只有十几年经验积累，作为大宗原料发酵，豆粕发酵工艺没有明确检测参数，没有完整，严格的过程控制的现状，是不能实现稳定化生产的。

豆粕发酵规模化，工业化的要求，是全过程可控，目前的固体发酵技术积累不能实现这个目标。

2.2.2固体发酵的物料性质（与液体深层发酵相比较）

造成这种现状的另一个原因是固体发酵的物料性质。

与液体深层发酵不同，固体发酵工艺往往不使用搅拌（浅盘或发酵床，固体发酵塔），或仅仅使用较温和的搅拌（绞龙式发酵槽）。与液体深层发酵工艺的剧烈搅拌与剧烈鼓泡不同，在液体环境下，认为任一个质点的情况代表了整个发酵罐任何一个质点的情况，在激烈的湍流下，液体深层发酵工艺的发酵液被认为是均匀的。而固体发酵工艺却不能被认为是均匀的，这样就使取样趋于困难。

由于任意选点不具备代表性，而取样方法并不是一般发酵过程工程师所关注的，也使检测项目的选取及对此的数据处理以实现过程控制的思路没有应用在固体发酵工艺中。

叶赫娜兰.孤城

3.        参照液体深层发酵建立固体发酵过程参数

现在的豆粕发酵，不应该继续农业发酵或食品发酵的工艺路线，现在的豆粕发酵没有得到，也不可能有时间得到几百年的经验积累。而液体深层发酵，却在近百年的发展中积累了大量的技术经验，包括检测方法，数据分析，控制反馈，甚至设备选型，物料平衡等等。第一步，先实现稳定的固体发酵工艺，参照液体深层发酵建立固体发酵过程参数，是必然的选择。

3.1液体深层发酵参数简介

液体深层发酵工艺认为，发酵液为一个均匀的，处于激烈湍流状态的气，液两相或气-液-胶三相的可压缩的非牛顿流体。在这个体系内，任一点的代谢状况，可以代表整个发酵罐内发酵液的代谢状况，则，整个过程监控过程，可以分为取样----检测/监测----反馈三部分，至于选取参数的依据，则坚持以下原则：

1，易于取得或检测。
2，与代谢实时相关。
3，抗干扰，检测值散布小。

鉴于以上原则，液体深层发酵的监测数据，并不是按照便于理科研究，二是便于工程操作选取的。

3.1.1常见液体深层发酵过程参数

发酵过程参数，一般等同于生理参数，用以反馈和控制整个发酵过程。

一般常见的生理参数为：pH值，生物量（用菌浓，湿菌体含量，干菌体含量，涂布菌落，细胞量，OD值等来表示），糖含量，氨基氮含量，可溶性磷含量，效价（目标产物含量），溶氧，尾气中氧，二氧化碳含量，发酵过程热量的产生速率（一般通过降温水流量标示），等等。其中，常用的为pH值，生物量，糖，氮，磷含量和目标产物含量。

其中，最为常用的是pH值，生物量，糖，氮，磷和效价。

包括pH，以上参数，基本可以看做是物质在水相里散布的浓度或其函数。依照这几个简单的参数的分析，可以确定液体深层发酵几乎全部的工艺要求，并实现严格的具有可重复性的发酵过程控制。

3.1.2检测参数（或曲线）的构成

不连贯的数据不能用来实现过程控制，不了解曲线的由来也不能进行有效的分析，必须明白参数的构成。

参数的构成，包含两个问题。第一是在认为搅拌均匀的前提下，数据的连续性问题。即取样受工艺反馈对发酵液浓度稀释或浓缩或改变，是否能够表现代谢过程的问题。第二是检测曲线构成或曲线复合的问题，也即真实度的问题。

面对第一个问题，由于所有生理参数都是用浓度来表示的，以最常用的分批补料发酵，看某底物（或产物）总量变化的情况下，不计误差时，在检测上的表现。

C1=S1/V1

C2=S2/(V1+V2-V3-V4)

△C=C2-C1

其中，C1为上班次检测值，C2为本班次检测值,△C为本班次变化值。
S1为上班次总底物量，S2为本班次总底物量。
V1为上班次发酵液体积。
V2为上班次补料量。
V3为上班次取样量。
V4为上班次呼吸损耗量。

事实上是，与V1相比，取样量和呼吸损耗基本可以忽略，而总补料量虽然很大，但每班次的补料量不会超过总体积V1的1/20，这时的误差，当S相对V1很小时（这正是液体深层发酵的特点），相对于检测的系统误差，还是比较小的。所以，在液体深层发酵中，工艺反馈对数据的影响是在可接受的范围之内的。即，对于发酵过程，在检测误差可以接受时，把C1，C2看做连续的监测数据是可信的。也即△C可以看做是由于连续的代谢被细胞合成消耗或细胞裂解释放的某底物变化。

第二个问题，即检测值C=f(t)------（t为时间）的参数构成，或当C绘成曲线后，该曲线是由几条曲线复合而成。

除了C函数所试图表现得S的真实浓度，也即真实值外，C还由另外两个函数构成。

首先，由于液体深层发酵的发酵液是气-液-胶三相的非牛顿流体，且随着时间的进行，粘度这个监测误差函数的影响最大的参数也越来越大，所以粘度误差会是一个在X轴两侧振幅越来越大的一个震荡函数。

其次，是监测的随机误差。

这两个误差也是C曲线的重要构成部分。

由此可见，虽然我们得到了唯一的检测值，但C=f(t)表现得不是S浓度的真实值。检测值将会随发酵时间的延长而受到更大的干扰。

C构成的曲线是连贯的（第一个问题），又是不能完全信赖的（第二个问题），在这种情况下的数据分析，液体深层发酵工艺的基于监测的过程控制积累了大量的数据处理技巧（如差商，拟合等）与经验。

类似的情况，会出现在固体发酵等任何需要选取过程参数和分析过程参数的工艺过程中，液体深层发酵的监测与分析技巧，也必须在固体发酵过程控制中得到借鉴和应用。

3.2参照液体深层发酵初步建立固体发酵过程参数

固体发酵（包括豆粕发酵），其过程控制，不应该选用传统发酵的以来经验的模糊模式，而应该建立一套有效地，全面的，实时控制的检测-反馈体系，以实现工艺过程的可重复性以及产品的稳定性。

经历了长时间的大工业生产，类似的体系，在液体深层发酵工艺中已经广泛应用，在建立固体发酵的检测-反馈体系时，可以借鉴其思想，方法和技巧。

3.2.1拟建立的取样方法与拟检测过程参数

一旦突破固体发酵渊源方面的限制，而进行生理参数的选取和检测，则在借鉴液体深层发酵工艺以建立检测体系的过程中，最大的障碍就是物料的物理性质。

由于固体发酵物料不是均匀的，这就要求取样不能任意选取，而应该在最能代表大部分或绝大部分物料的点，选取不止一个的点进行检测，然后去掉离群值，平均其余的检测点以尽可能得到散布较小的，有连贯性的数据。

按照发酵行业检测的习惯，所有生理参数检测都是在较稀的水溶液中进行。工业化检测的经验显示，在水溶液中进行的定量检测，比固体条件下的检测要精确地多。依照这个惯例，固体发酵工艺过程参数也应该选用与液体深层发酵类似的过程生理参数。

另一方面，选用类似的参数的另一个好处，是借鉴液体深层发酵对数据处理的经验。必经，所有发酵过程工程师是面对同样的参数进行工作的。

固体物料有固体物料的特点，所取样本，也为固体，这就需要溶解到定量的水溶质中，来进行检测和比较。目前，本实验室暂定为：

迅速烘干样品至恒重，然后称量10g至100g纯水中，震荡溶解，取上清液检测。检测项目与检测方法参考液体深层发酵。

这样，可以进行比较的是pH，糖，氮，磷。

还有一个重要的参数是生物量的检测。在液体深层发酵工艺中，生物量用离心法得到菌体，然后烘干测干菌重或不烘干测湿菌重，有时，也用比色法或血球计数仪，平板涂布测菌数。

但是固体发酵没有可以类比的可行的检测方法。不仅仅离心不可取，由于很多时候在微观环境物料的营养水平也有差异，造成生长不均匀，即便平板涂布也不能体现代谢情况，更不能使检测值的散布被允许在可以保证数据连续性的范围内，也就没有进行曲线分析的意义。在固体发酵中，用直接测量生物量的方法不能进行过程分析和控制。

这样就引入一个新的参数，用能量损耗的总量来衡量代谢过程，就可以通过计算函数的导数得到代谢强度，取代原来液体深层发酵中对生物量及其变化的描述。

这个量即单位重量的物料经过一定时间发酵后重量的变化。暂命名为“失重比”。

3.2.2按预想取样方法，比较液体深层发酵，固体发酵过程生理参数的构成

比较液体深层发酵，固体发酵的过程生理参数同样面临数据连续性和真实度的问题，对于发酵过程控制来说，没有解决这两个问题的数据是没有意义的数据。

由于检测方法的雷同，关于真实度的问题固体发酵面临着与液体深层发酵相同的曲线构成，即，检测曲线是由真实值和一个震荡函数与随机函数复合而成的。在曲线中，震荡函数和随机函数对数据的影响，可以通过经验和数据处理技术尽可能的去除。这里借鉴液体深层发酵的技巧。另一方面，看一下数据连续性。

在固体发酵过程中，检测值的索取是取样后烘干重溶后检测的到的，所以，水分的变化可以不予考虑。那么：

C1=S1/G1

C2=S2/（G1-△G）

△        C=C2-C1

其中，C1为上班次检测值，C2为本班次检测值,△C为本班次变化值。
S1为上班次总底物量，S2为本班次总底物量。
G1为上班次发酵液重量。
△        G为上班次呼吸消耗量。
   
    虽然在整个固体发酵过程中，重量损失是不容忽略的。因为工艺和菌株的不同，重量损耗可从10%-30%不等，但由于取样点密集，每班次的损耗不会很大，所以可以看做G1≈（G1-△G），即，固体发酵的检测数据是连续的，能够依此进行过程分析。

叶赫娜兰.孤城

4.        失重比，pH，还原糖与氨基氮的检测实例
   
为了验证参数选取的合理性与可行性，进行了部分发酵豆粕固体发酵工艺过程控制的探索，以下是其中一个实例。

实验地点：山东大学生命科学学院，微生物技术国家重点实验室，国家糖工程技术研究中心，资源糖室。

所用设备：摇床，50升自控发酵罐，固体发酵床，烘干箱，定量取样器（自制），常规检测设备。

所选菌株：米曲霉AS3951，为资源糖室保藏。

工艺条件：固体发酵，物料浸泡但不消毒。控制温度为发酵室空气温度30℃，料温35℃。起始pH6.5。控制湿度接近饱和。

工艺配方：干物料85%豆粕，其余略，含水量略。

取样周期：每三小时一次。

发酵数据：见表1（由于应用大量磷酸盐为缓冲剂，溶磷在较大的基数下为一平行于x轴直线，故表中没有列出相应的检测数据）。

周期        0        3        6        9        12        15        18        21        24
失重比        0%        0.5%        3.0%        7.0%        8.0%        14.0%        16.0%        17.0%        17.0%
pH        6.55        6.48        6.45        6.41        6.54        6.87        6.90        6.95        6.85
还原糖        3.2        3.4        3.8        3.0        1.8        1.4        1.4        1.4        1.4
氨基氮        320        320        320        280        400        480        520        360        360

   表1    豆粕发酵过程参数

如表1所示，在15小时后，物料的pH已经下降到最低点，并且反弹。而氨基氮则在15小时后达到最高，以后逐渐下降。同时，在15小时达到能耗速率最高，表现为相对失重比（失重比的斜率）最高。也就是具有较高代谢活性的生物量达到最高。以后，相对失重比降低并趋于平缓，说明进入稳定期和衰退期。

事实证明选取的过程参数在描绘和控制发酵过程上是有效的。在建立了有效地检测/监测机制后，发酵豆粕乃至整个固体发酵工艺，将摆脱不能控制的局面，而大幅度提高工艺稳定性。

参考文献：

《微生物技术开发原理》，曲音波，化学工业出版社
《生物体系中的化学测量》，上官棣华，赵睿等译，化学工业出版社
《微生物学》，郭秀君，山东大学出版社
《发酵豆粕研究进展》，李建，《粮食于饲料工业》，2009，NO.6