我国动物微生态产业存在的问题与发展对策 转载

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动物微生态学的发展，使人们对动物肠道微生物菌群的作用有了更深刻和更广泛的认识；同时，由于在畜禽养殖业和饲料中长期地、过量地和不合理地使用或滥用抗生素，出现了一系列问题，如引起动物体内菌群失调或紊乱或条件性致病菌异位转移、多重耐药性菌株产生(Alanis, 2005)以及在畜禽产品(如肉、蛋、奶)中的残留和环境污染等，特别是抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhoea)、耐药性艰难梭菌腹泻(drug-resistance Clostridium difficile-associated diarrhea)和耐药性过路菌腹泻(如环境中的耐药性大肠杆菌、沙门氏菌等)，正严重危害着畜牧业的健康发展，导致用药无效或用药量增加，恶性循环。同时，由于广泛的耐药细菌引发的感染也是21世纪严重危害人类健康和安全的重大问题之一。为此，国内外科学界和产业界都在积极探索和寻找抗生素替代品，这包括微生态制剂(Microecological preparation)又称直接饲喂的微生物(Direct-fed microbials，DFMs)或益生素(Probiotics)或微生物饲料添加剂(microbial Additive)或微生态调控剂(Microecological modulator)以及益生元(Prebiotics)、植物提取物(Plant extract)、生物活性肽(Bioactive peptide)或抗菌肽(Antimicrobial peptide)、免疫调节剂(immunomodulator)等，纵观国内外的发展情况，微生态制剂将会成为抗生素替代品的主力军(Trafalska and Grzybowska, 2004; Valentine, 1955)，而且目前市场上微生态制剂的品种也越来越多，从菌种品质上讲，可谓是优劣混杂；从剂型上看，有液剂、粉剂、半干半湿粉等；活菌标示值上，也是高高低低，真假难分；菌种安全性上也缺乏认真的评价。因此，为了使消费者对微生态制剂的品质、优劣等有更深刻和全面的了解，为了推动我国建立微生态制剂的规范和标准，本文将重点阐述国内微生态产业在菌种安全性、产品功能性和生产加工技术等方面存在的一些问题、国外同类产品的评价标准和解决我国益生素产品现存问题的对策，以便使微生态产业得到良性发展，为我国的食品安全作出重要贡献。
1  畜禽肠道微生物菌群有着重要的生物学功能，实施有益的调控，可促进其生长发育、营养物质的消化吸收和改善健康状况，从而减少抗生素的用量，提高我国的食品安全。动物自出生后就立即处于微生物世界的包围中，机体凡与外界接触及相通的部位皆有微生物的存在。在非反刍动物的胃肠道(Gastrointestinal tract,GIT)栖息着300～500种的微生物被称为微生态系统(Microbial ecosystems)，包括需氧或厌氧的细菌、真菌和酵母等，每克肠内容物中的微生物数量高达1010～1011个，超过机体细胞总数的10倍，这些胃肠道微生物(Gastrointestinal microbiota)群系之间及微生物与动物之间形成了相互依存、相互作用的不可分割的整体，参与了动物体的生长、发育、消化、吸收、营养、免疫、生物拮抗及其各种功能和结构的发生、发展和衰退的全过程。消化道正常微生物菌群(Normal microflora/microbiota)可根据其作用分为三类：①共生性细菌：是主要菌群(＞90%)，主要指专性厌氧或兼性厌氧菌如乳酸菌和双歧杆菌，这类生理性细菌数量大，恒定存在，对机体有益无害，在维持消化道微生态平衡上起着重要作用，同时，起着提供或丰富营养、促进消化、刺激免疫和消除肠内毒素等作用。共生菌与肠上皮密切接触，其生理和代谢活动与细胞的生理和代谢活动密切相关，甚至融为一体。这类细菌可以自营同时又可利他(宿主)，细菌将复杂的碳水化合物(纤维素或非淀粉多糖)发酵成为乳酸或挥发性脂肪酸(如丙酸)。乳酸在肠道形成酸性环境，对其它致病菌可产生“竞争排除作用”，但乳酸堆积多也會刺激肠道蠕動，使肠道内容物排空加快。②机会性细菌：约占10%，包括无病原性的大肠杆菌、链球菌及肠球菌等。这些机会性细菌视肠道环境而改变停留在肠道的数量及時间。③致病性细菌：含量极少(＜0.01%)的致病性菌群，包括梭菌、葡萄球菌、伪单胞菌、病原性大肠杆菌、沙门氏菌以及部分真菌。这类菌群不仅具有致病性，同時他們也会消耗宿主的能量，而其发酵產物(如氨气、H2S等)也可能对宿主有害，还导致体内腐败物、致癌物及毒素的增加。正是动物肠道中的大量微生物与其所处的微环境构成了“微生态三角”，即在宿主遗传的控制下，正常微生物菌群、免疫与营养构成的相互依赖、相互制约的关系。正常的微生物菌群的生理功能是动物生存必需的一个生理系统，动物是动物真核细胞和细菌原核细胞构成的综合体，微生态系统是除骨骼、肌肉、神经、附属(皮、毛、指或趾甲)、淋巴(免疫)、呼吸、消化、内分泌、心血管、泌尿、雄性和雌性生殖系统(Morieb,1995)之外的第十三个生理系统。第十三系统发挥着一系列重要的作用：①胃肠菌群促进胃肠黏膜细胞的发育和成熟(解剖修饰作用)；②肠粘的菌群屏障作用；③口服耐受性和激活免疫系统，促进免疫细胞成熟，包括B细胞、T细胞、M细胞及吞噬细胞、体液免疫、细胞免疫、产溶菌酶细胞等；④产生多种消化酶，促进营养消化、吸收和代谢，包括对蛋白质或氮素、脂类、碳水化合物、维生素、无机盐和黏液代谢等；⑤胃肠菌群产生迁移传动复合物(migrating motor complexes,MMC),刺激肠蠕动；⑥代谢产酸，酸化肠道环境，活化酶系统和抑制偏碱性有害微生物的生长。动物的微生态系统就是通过上述多种作用，最终产生抑制有害菌群，增强免疫功能，防治疾病，提高饲料营养素的消化吸收和转化效率，促进动物产品(肉、蛋、奶、毛、皮等)的形成和品质改善。可见，胃肠道微生物存在复杂的多样性，因此表现出菌群和功能的多样性。动物体内各种微生物的组成和结构(比例)直接影响其生命活动向或好或坏的方向发展。因此，对胃肠道微生物进行调控有着重要的实践意义。
微生态制剂又称益生素(Probiotics)是一种重要的肠道菌群调节剂，传统概念认为，益生素是指摄入动物体内参与肠内微生态平衡的具有直接通过增强动物对肠道有害微生物的抑制作用，或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，而间接起到促进动物生长作用和提高饲料转化率的活性微生物培养物。1994年在德国举行的国际会议上，各国微生态学家在总结该学科近些年研究成果的基础上，给益生素赋予了新的内涵，一致认为，益生素是含活菌和(或)死菌，包括其组分和产物的细菌制品，经口或经由其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制。这个概念能更加准确、全面地概括益生素的组成和功能。对肠道菌群的调控有着重要的作用，主要包括：①对营养物质消化吸收利用条件的重建；②免疫力或抗病力的重建；③生长条件的重建。
2  饲料安全、人类的食品安全和健康需要微生态制品近年来的大量研究表明，人类常见的健康问题如癌症、畸形、抗药性和某些中毒现象与肉、蛋、奶中的抗生素、激素和其它合成药物的残留有关，从而促使各国纷纷立法限制和禁用抗生素、激素等添加剂在饲料中的使用，如欧盟农业委员会立法从1999年7月1日起禁止在饲料中添加杆菌肽、螺旋霉素、维吉尼亚霉素、泰乐菌素4种抗生素；2003年1月欧盟农业委员会立法到2006年1月全面禁止目前仍然使用的4种饲用促生长抗生素，即黄霉素、莫能霉素、盐霉素和卑霉素。与此同时，益生素以其绿色安全、无毒副作用、无残留的优点而备受饲料生产企业和畜牧养殖者的青睐，并得到广泛应用。益生素作为一种抗生素替代品，在发展绿色畜牧业、提高饲料和食品安全、促进人类健康方面有着重要的作用。
但是，目前国内微生态制剂正处于发展阶段，由于各生产厂家生产工艺不一，造成产品质量参差不齐，再加上用户选择和使用不当，而出现使用效果不同、褒贬不一的局面，影响了微生物作为抗生素替代饲料添加剂的发展。这样不利于我国微生态制剂(益生素类)产业的良性发展。
3  国内益生素制剂现存的主要问题及国外的评价标准3.1 菌种(菌株)选用不规范或变异性较大3.1.1 益生素菌种属、种、株(Genus/species/strain)菌种是微生态制剂生产的关键，也是微生态制剂质量的直接和重要保证。各国对作为益生素的菌种(菌株)都有明确规定，如1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)公布了43种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株，主要有细菌(bacteria)、酵母(yeast)和真菌(fungi)，其中乳酸菌28种(包括乳酸杆菌12种、双歧杆菌6种、链球菌6种、片球菌3种、明串珠菌1种)、芽孢杆菌5种、拟杆菌4种、曲霉2种、酵母菌2种等。其中，①乳酸杆菌属(Lactobacilleae)12种：短乳杆菌(L. Brevis)、嗜酸乳杆菌(L. Acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L. Bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.Casei)、纤维二糖乳杆菌(L. Cellosus)、弯曲乳杆菌(L. Curvatus)、德氏乳杆菌(L. Delbruekii)、发酵乳杆菌(L. Fermentum)、罗特氏乳杆菌(L. Reuterii)、乳酸乳杆菌(L. lactis)、植物乳杆菌(L. Plantarum)。②双歧杆菌属(Bifidobactirium)6种：青春双歧杆菌(B. adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B. infantis)、动物双歧杆菌(B. animalis)、长双歧杆菌(B. longum)、嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)、两歧双歧杆菌(B. bifidum)。③肠球菌属(Enterococcus)2种：粪肠球菌(E.faecalis)又称粪链球菌(S. faecium)、屎肠球菌(E.faecium)又称屎链球菌(S. faecium)。④链球菌属(Streptococcus)5种：嗜热链球菌(S. thermophilus)、乳酸链球菌(S. lactis) 又称乳酸乳球菌(L.lactis)、中间型链球菌(S. intermedius)、乳脂链球菌(S. cremoris)、二丁酮链球菌(S. diacetylactis)。⑤芽孢杆菌属(Bacillus)5种：凝结芽孢杆菌(Bacillu coagulans)、缓慢芽孢杆菌(B. lentus)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniforms)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)。⑥明串珠菌属(Leuconostoc)1种：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。⑦片球菌属(Pediococcus)3种：乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(P. cerecisiae)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)。⑧乳球菌属(Lactococcus)1种：乳酸乳球菌(L.lactis)又称乳酸链球菌(S. lactis)。⑨丙酸杆菌属(Propionibacterium)2种：谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)、费氏丙酸杆菌(P. Freudenreichii)。⑩拟(类)杆菌属(Bacteroides)4种：猪拟(类)杆菌(B. suis)、瘤胃生拟(类)杆菌(B. ruminocola)、多毛拟(类)杆菌(B. Capillosus)、嗜淀粉拟(类)杆菌(B. amylophilus)。酵母菌属(Yeast)2种：啤酒酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)。曲霉菌属(Aspergillus)2种：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A. oryzae)。
      我国农业部1999年6月公布(105号公告)了可以直接调喂动物的饲料级微生物添加剂菌种有12个：干酪乳杆菌( Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(L．Planetarium)、嗜酸性乳杆菌(L．Acdophilus)、粪链球菌(Straptoccus  faecium)、乳链球菌(S．Lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B．natto)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒酵母(Sacchace  cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
FAO/WHO《关于食用微生物选用评价规则》(FAO/WHO, 2002)指出，食用微生物的菌株必须通过表型和基因型的鉴定，并通过体外和动物试验证明有明确的功能和良好的安全性，还要通过1期临床试验。
1989年美国FDA把传统上通称的益生素定义为可直接饲喂的微生物(Direct-fed microbials, DFMs)，这些微生物菌种应具有以下特性：①产生有机酸，如乳酸、乙酸、甲酸等，这些酸能够抑制病原微生物，也可作为动物的能量或对其他微生物有益；②产生抗菌物质，如细菌素、过氧化氢或其他化合物抑制病原微生物；③有益微生物粘附占位，竞争排除，防止病原微生物定植；④刺激免疫反应，增加免疫系统活力；⑤产生各种消化酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和糖苷酶(glycosidases)，提高饲料利用效率，此外双歧杆菌还产生DNA聚合酶可修复机体损伤的细胞；⑥减少毒胺的产生，中和内毒素。
3.1.2 益生素菌种的选择标准1992年R.Fukker提出作为益生素的菌种应符合以下标准：①微生物必须是大规模工业生产的活菌制剂；②在保藏和使用期间，应保持稳定的活菌状态；③必须能在人体肠道中存活；④必须对宿主产生有益作用；⑤应是人体肠道正常菌群的成员(具有调节和有益作用的外来菌也可以)。
目前国内有些厂家的菌种(菌株)实际并没有严格按照微生物的标准进行筛选。有些同一名称种属下的菌株可能存在很大差异，虽然有些菌种“名称”相同，如都是乳酸菌或酵母菌或芽孢杆菌或双歧杆菌，但是由于同名菌种的不同菌株的生理特性(如生长快慢、最佳生长温度、所需生长环境或条件、世代间隔、代谢产物等)和功效性存在较大差异，最终表现的功效也会有明显不同。由于这方面的差别，导致含有相同名称菌株的益生素产品，表现出明显不同的功效，这如同不同人与人之间的能力、本领、财富等方面有天壤之别一样。因此，生产微生态制剂的菌种必须经过严格筛选，这是生产出高质量的微生态制剂的关键。
3.2 菌种的安全性评价缺乏系统的证据国内有关微生物的安全性试验研究较少，多数试验厂家仅研究了微生态制剂的产品功效，测定指标为动物日增重、饲料转化率、肠道微生态的影响和宿主发病率和死亡率评价，而对宿主、畜产品和人类食物链的安全评价试验很少。为了人类自身安全、食品安全和环境污染应更多关注微生物安全性研究。
3.2.1 菌种安全性作为饲料添加剂的菌种(菌株)应经过严格的病理与毒理试验，证明无毒、无致畸、无耐药性、无药残等副作用。一株现在无毒副作用的菌种，将来也可能会因为理化、微生物毒素和菌种本身原因引起负性突变，所以应定期对生产菌种进行安全性检测或评价(Sipsas et al.,2002; Sorokulova et al., 2006; Zhou et al.,2000)。检测项目包括：药物抗性试验、质粒检测、急性和亚急性毒性试验、致癌性试验、半致死量试验、毒物酶类产生试验、代谢产物分析试验(Saarela et al.,2000; Saavedra et al.,2004)。
3.2.2 潜在致病性研究和感染能力的检测有益微生物在体内正常微生态条件下，对其宿主动物具营养作用，但在某些条件下可能产生致病性，如近几年有关乳酸杆菌引起临床感染的报道。因此，使用微生态制剂时应综合考虑动物健康状况及其它因素以确保安全。
没有致病性、感染性应该是微生物安全性必须具备的条件(Saarela et al.,2000)。要证明微生物是否具有感染性很困难，特别是厌氧菌。对弱感染力的细菌，即使给健康动物大量口服也不会引起感染。一般采用抗生素脱污染或口服免疫抑制剂等方法，造成动物的菌群屏障功能和免疫功能丧失，再喂给微生态制剂，检查其是否引起感染。另外，采用无菌动物或悉生动物检查微生物的感染。
3.2.3 菌种携带抗生素抗性基因的可能性在养殖业中广泛使用抗生素，使携带抗生素抗性基因的微生物得以繁殖，而微生物的抗性基因一般存在质粒上，质粒是游离于染色体外的小分子遗传物质，且有很高的迁移性（飘移），容易在不同微生物间传递，抗性基因也随之转移，这对人畜危害很大。作为益生素的菌株不得携带抗生素抗性基因(Saarela et al.,2000)。因而，研制和开发安全性高的、无耐药性的微生物制剂，是涉及人类安全与生态环境的重大问题。
3.2.4 环境破坏的可能性某些菌种的大量应用，通过动物排泄到周围环境中，形成优势菌种，可能对改变周边微生态系统，对其是否造成危害应长期监测观察。
目前国内的问题是，不少厂家的微生态制剂缺乏潜在致病性和感染力检测，同时，国家也没有制订相应的检测标准和方法。就上述4个方面而言，国内仅规定要做急性、亚急性毒性试验，其他安全指标(即3.2.2～3.2.4)均没有指定要测试。
3.3 对菌种的功效评价指标单一，简单粗糙，缺乏系统性目前国内有关微生物功效的报道仅局限在产品试验效果的观察上，更应对微生物的作用机理应作系统研究。
3.3.1 功效性评价微生物的功能至少应包括：益生菌对免疫调控作用、对肠道菌群的调控、对腹泻的防治能力、对宿主生理功能(如生产性能)及饲料利用率的影响(Saarela et al., 2000)。
3.3.2 抗逆性研究不同微生物在体内外抵抗胃酸能力、抵抗胆汁酸盐和耐受一定加工温度(70～90℃)的能力。微生物耐酸力与抗胆盐能力进行体内试验难度太大，现多用体外试验作为评估菌株的耐酸性的相对参考标准(Tuomola et al.,2001)。
3.3.3 定植粘附能力微生物在肠壁上的黏附是微生物定植过程中的一个重要步骤，是大量繁殖变成优势种群的前提，粘附能力与抗腹泻、免疫力、竞争排斥及其他有益作用密切相关, 目前用体外试验来研究和测定(Nemcova,1997; Saarela et al.,2000)。而菌株的黏附力在不同的环境会发生变化，同一菌株体外模型不同黏附情况不同，即使同一菌种的不同菌株对同一模型的黏附能力也是不同的(Lehto和Salminen,1996)。
3.3.4 稳定性益生菌在饲料产品中活菌的生物学特性、遗传学特性应该稳定，在使用和贮存期间，应保持稳定的活存状态。
在上述4个方面，国内的问题表现比较突出。一些企业仅重视功效性试验，而没有进行稳定性试验、定植粘附能力和抗逆性试验。这给一些研发能力弱、生产水平低下的企业带来了可趁之机，以致于生产出来的产品表现出稳定性差、批与批之间功效差别较大的问题，也影响了消费者对这类产品的信任度。
3.4 菌株的来源和保存条件不合理微生态制剂不同于其它饲料添加剂，它是繁殖和变异很快的活的生物体，对其来源、保存与利用都应有严格的规范和操作程序。　
①菌种来源：菌种来源历史应清楚，以专门机构审查认可并同意，方可用于生产。保存和分发也应由专门机构负责或由研制单位专门管理部门保存和分发。
②菌种保存与利用：生产用菌种应先制成冻干粉，即在菌种管中冷冻干燥一大批，并保存于2℃～3℃以备生产使用。
③冻干菌种检定合格后才可投产，生产程序为：冻干粉→液体活化→摇瓶→一级种子瓶或二级种子→生产罐发酵。
④菌种传代不应超过5代，因过多过传代易造成细菌某些生物特性变异。
⑤生产用菌种要求长期延续保持原有特性，菌种必须专人管理，经常定期检查，并应建立菌种档案资料，包括来源、历史、筛选、检定、冻干保存、数量、启开使用等完整的记录，这些都须专门管理部门专门人员承担。
3.5 生产加工技术不够合理和科学目前国内有些微生物生产厂家设备简单，问题较多，主要表现在以下几个方面：
①生产用的菌种来源不规范。一些厂家所用的菌种不是祖代经冷冻干燥保藏的菌种，而是原种经多次传代的菌种，是否已经产生变异并不清楚；或通过摇瓶后直接接种到并没有灭菌的固体培养介质上放大生产，或任意比例放大生产，导致产品中杂菌严重超标，甚至杂菌占据了优势，以致于使用此类产品后没有明显的功效。
②多菌种任意混合，生产微生物添加剂。如目前国内生产的益生素制品含有5科10属80多种微生物，其菌种也未经过鉴定和安全性评价，使用此类产品存在潜在的风险。建议益生素生产企业在复合菌制剂时，要进行科学合理的设计，使用什么样的菌种、用几个、如何进行工艺控制等都要周密考虑。
③生产工艺简单，质量控制不严。目前的生产工艺流程主要有固体发酵、液-固发酵(即先进行液体发酵，然后接种到固体培养基上放大发酵)和液体发酵几种生产工艺。
固体表面发酵法：是把固体表面培养物与载体按比例混合经干燥制成，此法生产的产品目标微生物的含量低，易受杂菌污染，质量难以控制，不适于工业化生产，但投资少。这是目前大部分微生物生产厂家所采用的方法，也是目前影响微生态制剂推广应用的主要不利因素。
应采取的正确工艺路线是液体深层高密度发酵，即：祖代菌种冻干粉→活化→纯化→接种摇甁→一级种子或二级种子(在发酵罐中进行)→生产罐发酵→发酵液→后加工(或喷雾干燥、或浓缩后冷冻干燥、或载体吸附干燥、或微胶囊包被)→筛分→质检→微生态产品。此法适于工业化生产，便于无菌操作，但成本高，生产过程能够严格控制，目标菌(有效菌)含量高，杂菌少，菌种纯度高，功效明确，也是技术和资金力量较强的企业采取的生产工艺。例如，由中国农业大学承担完成的国家“863”高技术计划和农业“跨越计划”——“安全高效微生物饲料添加剂‘益生康’中试放大产业化和应用技术”就是应用这种技术方案。一些发达国家和地区如美、日、欧等生产的高品质微生态制剂也是如此。
生产工艺条件对质量很大影响, 如发酵温度和时间会影响产品的质量，干燥工艺和温度和时间会影响微生物的存活率和活性。例如，使用嗜酸乳酸杆菌，在37℃培养12h与32℃培养48h的同一出发菌株，其终端代谢产物和作用效果有很大不同。
④干燥方式不科学。干燥过程最易引起菌种存活率降低，目前常用的干燥方式为喷雾干燥和冷冻干燥。
喷雾干燥导致菌种的存活率偏低，大多数嗜温菌的存活率仅为10%，某些乳酸菌的存活率为44%。冷冻干燥由于是在低温下进行，可提高存活率，绝大多数菌种均可通过冷冻干燥而保存。
⑤产品包装和剂型不规范　
由于大多数微生态制剂对空气中的氧敏感,因而应选用密封防潮性能好的包装材料。塑料薄膜因其透气性、透湿性、化学稳定性和耐热性较差,不宜作为微生物的包装材料,而应选用密封防潮性能好的铝箔或高质量密封好的无毒塑料甁的作为包装材料。
剂型以微胶囊和双层胶囊为理想，其它如粉状和粒状都不耐加工和贮存。
随着微囊工艺、缓释技术和基因工程等新技术的发展, 这些新技术也将在微生态制剂产业中得到广泛应用。
3.6 微生态产品标示不明确或标示值(label claims)与实际含量(actual contents)不符微生态产品应明确标示产品相关信息，包括：
菌种名称：标准的中文菌种名称、拉丁文菌种名称以及菌种来源。
有效菌数和活力：产品应标示在产品保质期内的有效菌数即产品标示值(label claims)或保证值，即微生态制剂中能添加饲料中有效活菌数(指每克成品当中所含有的有效活菌数量)。国内一些益生素产品的实际活菌数远远低于其标示值，问题比较突出。在国外，南非的Elliot and Teversham(2004)评价了9个从美国和欧洲进口的益生素产品，结果发现仅有5/9产品的标示值与实测值相符，3/9的产品标示的菌种与实际相符。
此外，还包括产品功效、配伍禁忌、使用方法、产品保质期、生产日期等。
4  对国内微生态行业的几点建议    如前所述，随着抗生素的负面影响暴露的越来越多，微生态制剂必将在替代抗生素、提高饲料和食品安全等方面发挥重要作用。但是，微生态产业目前存在一系列问题，为了促进微生态产业的健康发展和发挥其优势作用，提出如下建议，以供本行业和政府部门参考。
4.1 尽快建立有关产品标准国家有关部门尽快建立饲用微生物和微生物饲料添加剂质量监督检验测试中心，组织专家建立有关微生态产品标准、生产工艺标准，这是国家对微生态制剂实行监督的准绳，也是国家对微生态制剂生产和质量的最低要求。微生物标准化是组织微生物生产和提高制品质量的重要手段,在饲料添加剂行业标准尚未建立之前，可参照FAO/WHO制订的评价标准《Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food》或国内医药行业《生物制品试行规程》，它是我国生物制品的国家标准和技术法规，包括生产和检定的技术指标。它来源于生产，反过来又指导生产，不但规定了生产和检定技术指标，还对原材料、工艺流程、检定方法等作了详细的规定，对制品质量起到保证作用。
4.2 政府部门加强市场监督政府有关部门通过加强对饲料添加剂生产企业的管理，对生产企业的生产条件应严格按兽药生产规定和符合GMP标准。
严格把好微生物产品批准文号的审批关，要求生产企业提供产品的详细资料，如菌种的来源和筛选、菌株的诱变、菌株配伍以及产品的毒理学和流行病学研究的资料。对企业的产品生产和研发过程中进行安全监控，并严厉打击假昌伪劣产品产品流入市场。
4.3 微生态制剂生产企业尽快生产出标示规范、安全高效的名优产品，占领和引导市场。企业应根据微生态制剂的法定标准和自身的生产工艺制定高于法定标准的内控标准。严格按照制定的标准对原辅料、包装材料、中间体、半成品和成品进行检验。加强生产过程中的质量监督,生产出安全高效的微生态制剂产品。
4.4 增加饲料生产企业和养殖户对微生物的科学认识，达到合理使用，发挥效益。微生物作为饲料添加剂可改善动物肠道微生态环境、提高营养物质消化率，增强机体免疫力、清除体内毒素，提高宿主对疾病抵抗力而逐渐在生产中应用。其使用效果与添加微生物的数量密切相关，数量不足在体内不能形成优势菌群， 难以起到益生作用； 然而杂菌数量过多，反而会引起仔畜禽腹泻或消耗营养，甚至影响了动物的生长发育。此外，还应针对不同的畜禽和不同生长阶段，合理选择使用微生物品种和数量，以使经济效益最大化。
相信，只要有高质量的微生物种、科学合理的生产工艺、严格的质控措施和正确的使用方法，益生素产业一定会有强劲的生命力，并在促进饲料工业和畜牧业绿色化中发挥重要作用。

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3  国内益生素制剂现存的主要问题及国外的评价标准3.1 菌种(菌株)选用不规范或变异性较大3.1.1 益生素菌种属、种、株(Genus/species/strain)菌种是微生态制剂生产的关键，也是微生态制剂质量的直接和重要保证。各国对作为益生素的菌种(菌株)都有明确规定，如1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)公布了43种“可直接饲喂且通常认为是安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)”作为微生态制剂的出发菌株，主要有细菌(bacteria)、酵母(yeast)和真菌(fungi)，其中乳酸菌28种(包括乳酸杆菌12种、双歧杆菌6种、链球菌6种、片球菌3种、明串珠菌1种)、芽孢杆菌5种、拟杆菌4种、曲霉2种、酵母菌2种等。其中，①乳酸杆菌属(Lactobacilleae)12种：短乳杆菌(L. Brevis)、嗜酸乳杆菌(L. Acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L. Bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.Casei)、纤维二糖乳杆菌(L. Cellosus)、弯曲乳杆菌(L. Curvatus)、德氏乳杆菌(L. Delbruekii)、发酵乳杆菌(L. Fermentum)、罗特氏乳杆菌(L. Reuterii)、乳酸乳杆菌(L. lactis)、植物乳杆菌(L. Plantarum)。②双歧杆菌属(Bifidobactirium)6种：青春双歧杆菌(B. adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B. infantis)、动物双歧杆菌(B. animalis)、长双歧杆菌(B. longum)、嗜热双歧杆菌(B. thermophilum)、两歧双歧杆菌(B. bifidum)。③肠球菌属(Enterococcus)2种：粪肠球菌(E.faecalis)又称粪链球菌(S. faecium)、屎肠球菌(E.faecium)又称屎链球菌(S. faecium)。④链球菌属(Streptococcus)5种：嗜热链球菌(S. thermophilus)、乳酸链球菌(S. lactis) 又称乳酸乳球菌(L.lactis)、中间型链球菌(S. intermedius)、乳脂链球菌(S. cremoris)、二丁酮链球菌(S. diacetylactis)。⑤芽孢杆菌属(Bacillus)5种：凝结芽孢杆菌(Bacillu coagulans)、缓慢芽孢杆菌(B. lentus)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniforms)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)。⑥明串珠菌属(Leuconostoc)1种：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。⑦片球菌属(Pediococcus)3种：乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(P. cerecisiae)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)。⑧乳球菌属(Lactococcus)1种：乳酸乳球菌(L.lactis)又称乳酸链球菌(S. lactis)。⑨丙酸杆菌属(Propionibacterium)2种：谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)、费氏丙酸杆菌(P. Freudenreichii)。⑩拟(类)杆菌属(Bacteroides)4种：猪拟(类)杆菌(B. suis)、瘤胃生拟(类)杆菌(B. ruminocola)、多毛拟(类)杆菌(B. Capillosus)、嗜淀粉拟(类)杆菌(B. amylophilus)。酵母菌属(Yeast)2种：啤酒酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)。曲霉菌属(Aspergillus)2种：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A. oryzae)。
0 \8 m( y( b) Z- F9 E/ t# I      我国农业部1999年6月公布(105号公告)了可以直接调喂动物的饲料级微生物添加剂菌种有12个：干酪乳杆菌( Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(L．Planetarium)、嗜酸性乳杆菌(L．Acdophilus)、粪链球菌(Straptoccus  faecium)、乳链球菌(S．Lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B．natto)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒酵母(Sacchace  cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
) W& G1 {# j; U4 N4 B6 q  A1 tFAO/WHO《关于食用微生物选用评价规则》(FAO/WHO, 2002)指出，食用微生物的菌株必须通过表型和基因型的鉴定，并通过体外和动物试验证明有明确的功能和良好的安全性，还要通过1期临床试验。) {' z3 C8 ~( \$ F$ M' n* Q
1989年美国FDA把传统上通称的益生素定义为可直接饲喂的微生物(Direct-fed microbials, DFMs)，这些微生物菌种应具有以下特性：①产生有机酸，如乳酸、乙酸、甲酸等，这些酸能够抑制病原微生物，也可作为动物的能量或对其他微生物有益；②产生抗菌物质，如细菌素、过氧化氢或其他化合物抑制病原微生物；③有益微生物粘附占位，竞争排除，防止病原微生物定植；④刺激免疫反应，增加免疫系统活力；⑤产生各种消化酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和糖苷酶(glycosidases)，提高饲料利用效率，此外双歧杆菌还产生DNA聚合酶可修复机体损伤的细胞；⑥减少毒胺的产生，中和内毒素。
& p; O( t2 f$ `& P5 r; N4 A3.1.2 益生素菌种的选择标准1992年R.Fukker提出作为益生素的菌种应符合以下标准：①微生物必须是大规模工业生产的活菌制剂；②在保藏和使用期间，应保持稳定的活菌状态；③必须能在人体肠道中存活；④必须对宿主产生有益作用；⑤应是人体肠道正常菌群的成员(具有调节和有益作用的外来菌也可以)。4 N+ M3 P7 s1 P$ _7 D& _
目前国内有些厂家的菌种(菌株)实际并没有严格按照微生物的标准进行筛选。有些同一名称种属下的菌株可能存在很大差异，虽然有些菌种“名称”相同，如都是乳酸菌或酵母菌或芽孢杆菌或双歧杆菌，但是由于同名菌种的不同菌株的生理特性(如生长快慢、最佳生长温度、所需生长环境或条件、世代间隔、代谢产物等)和功效性存在较大差异，最终表现的功效也会有明显不同。由于这方面的差别，导致含有相同名称菌株的益生素产品，表现出明显不同的功效，这如同不同人与人之间的能力、本领、财富等方面有天壤之别一样。因此，生产微生态制剂的菌种必须经过严格筛选，这是生产出高质量的微生态制剂的关键。
4 R. H1 D1 T9 z# U8 c0 H" X6 Y3.2 菌种的安全性评价缺乏系统的证据国内有关微生物的安全性试验研究较少，多数试验厂家仅研究了微生态制剂的产品功效，测定指标为动物日增重、饲料转化率、肠道微生态的影响和宿主发病率和死亡率评价，而对宿主、畜产品和人类食物链的安全评价试验很少。为了人类自身安全、食品安全和环境污染应更多关注微生物安全性研究。" G4 V$ i' E% b
3.2.1 菌种安全性作为饲料添加剂的菌种(菌株)应经过严格的病理与毒理试验，证明无毒、无致畸、无耐药性、无药残等副作用。一株现在无毒副作用的菌种，将来也可能会因为理化、微生物毒素和菌种本身原因引起负性突变，所以应定期对生产菌种进行安全性检测或评价(Sipsas et al.,2002; Sorokulova et al., 2006; Zhou et al.,2000)。检测项目包括：药物抗性试验、质粒检测、急性和亚急性毒性试验、致癌性试验、半致死量试验、毒物酶类产生试验、代谢产物分析试验(Saarela et al.,2000; Saavedra et al.,2004)。
" I0 \$ q8 V5 {& z: O3 n) e3.2.2 潜在致病性研究和感染能力的检测有益微生物在体内正常微生态条件下，对其宿主动物具营养作用，但在某些条件下可能产生致病性，如近几年有关乳酸杆菌引起临床感染的报道。因此，使用微生态制剂时应综合考虑动物健康状况及其它因素以确保安全。7 v, O% A4 Q+ a  O  r
没有致病性、感染性应该是微生物安全性必须具备的条件(Saarela et al.,2000)。要证明微生物是否具有感染性很困难，特别是厌氧菌。对弱感染力的细菌，即使给健康动物大量口服也不会引起感染。一般采用抗生素脱污染或口服免疫抑制剂等方法，造成动物的菌群屏障功能和免疫功能丧失，再喂给微生态制剂，检查其是否引起感染。另外，采用无菌动物或悉生动物检查微生物的感染。$ o, T0 h  w# _. U( I
3.2.3 菌种携带抗生素抗性基因的可能性在养殖业中广泛使用抗生素，使携带抗生素抗性基因的微生物得以繁殖，而微生物的抗性基因一般存在质粒上，质粒是游离于染色体外的小分子遗传物质，且有很高的迁移性（飘移），容易在不同微生物间传递，抗性基因也随之转移，这对人畜危害很大。作为益生素的菌株不得携带抗生素抗性基因(Saarela et al.,2000)。因而，研制和开发安全性高的、无耐药性的微生物制剂，是涉及人类安全与生态环境的重大问题。) N+ }3 d# W& k- S7 s
3.2.4 环境破坏的可能性某些菌种的大量应用，通过动物排泄到周围环境中，形成优势菌种，可能对改变周边微生态系统，对其是否造成危害应长期监测观察。- x0 P% J+ f6 h0 `8 Y* X: w2 S# J( X2 X& u
目前国内的问题是，不少厂家的微生态制剂缺乏潜在致病性和感染力检测，同时，国家也没有制订相应的检测标准和方法。就上述4个方面而言，国内仅规定要做急性、亚急性毒性试验，其他安全指标(即3.2.2～3.2.4)均没有指定要测试。
. e0 G' _3 n) c  Y! }9 D. R3.3 对菌种的功效评价指标单一，简单粗糙，缺乏系统性目前国内有关微生物功效的报道仅局限在产品试验效果的观察上，更应对微生物的作用机理应作系统研究。
! d% a; e; f  X3.3.1 功效性评价微生物的功能至少应包括：益生菌对免疫调控作用、对肠道菌群的调控、对腹泻的防治能力、对宿主生理功能(如生产性能)及饲料利用率的影响(Saarela et al., 2000)。
+ K1 j! I: T6 A. z: Q9 y, i( d3.3.2 抗逆性研究不同微生物在体内外抵抗胃酸能力、抵抗胆汁酸盐和耐受一定加工温度(70～90℃)的能力。微生物耐酸力与抗胆盐能力进行体内试验难度太大，现多用体外试验作为评估菌株的耐酸性的相对参考标准(Tuomola et al.,2001)。4 U; b. O- z  c& x" P& I% s
3.3.3 定植粘附能力微生物在肠壁上的黏附是微生物定植过程中的一个重要步骤，是大量繁殖变成优势种群的前提，粘附能力与抗腹泻、免疫力、竞争排斥及其他有益作用密切相关, 目前用体外试验来研究和测定(Nemcova,1997; Saarela et al.,2000)。而菌株的黏附力在不同的环境会发生变化，同一菌株体外模型不同黏附情况不同，即使同一菌种的不同菌株对同一模型的黏附能力也是不同的(Lehto和Salminen,1996)。& n+ h8 t; I1 }2 z
3.3.4 稳定性益生菌在饲料产品中活菌的生物学特性、遗传学特性应该稳定，在使用和贮存期间，应保持稳定的活存状态。
  l0 m- U4 ^/ n6 M( E2 Y- z在上述4个方面，国内的问题表现比较突出。一些企业仅重视功效性试验，而没有进行稳定性试验、定植粘附能力和抗逆性试验。这给一些研发能力弱、生产水平低下的企业带来了可趁之机，以致于生产出来的产品表现出稳定性差、批与批之间功效差别较大的问题，也影响了消费者对这类产品的信任度。4 [) ?. g8 x0 Z$ [9 E: k4 v, R+ V- _
3.4 菌株的来源和保存条件不合理微生态制剂不同于其它饲料添加剂，它是繁殖和变异很快的活的生物体，对其来源、保存与利用都应有严格的规范和操作程序。　; t( I5 S* `' w7 ]2 N
①菌种来源：菌种来源历史应清楚，以专门机构审查认可并同意，方可用于生产。保存和分发也应由专门机构负责或由研制单位专门管理部门保存和分发。; f4 H) U% Q) x2 B' \7 g
②菌种保存与利用：生产用菌种应先制成冻干粉，即在菌种管中冷冻干燥一大批，并保存于2℃～3℃以备生产使用。; @+ L$ s' e, a/ e) X9 N, b
③冻干菌种检定合格后才可投产，生产程序为：冻干粉→液体活化→摇瓶→一级种子瓶或二级种子→生产罐发酵。& h+ C! [, ~) n! q- Y" F9 R* L/ Y
④菌种传代不应超过5代，因过多过传代易造成细菌某些生物特性变异。
0 M! \! ~! b( ^) F⑤生产用菌种要求长期延续保持原有特性，菌种必须专人管理，经常定期检查，并应建立菌种档案资料，包括来源、历史、筛选、检定、冻干保存、数量、启开使用等完整的记录，这些都须专门管理部门专门人员承担。
) V" E/ f) ?! Z0 ~! H3.5 生产加工技术不够合理和科学目前国内有些微生物生产厂家设备简单，问题较多，主要表现在以下几个方面：9 N; F3 e' o$ p: J" \; _* z& e( f
①生产用的菌种来源不规范。一些厂家所用的菌种不是祖代经冷冻干燥保藏的菌种，而是原种经多次传代的菌种，是否已经产生变异并不清楚；或通过摇瓶后直接接种到并没有灭菌的固体培养介质上放大生产，或任意比例放大生产，导致产品中杂菌严重超标，甚至杂菌占据了优势，以致于使用此类产品后没有明显的功效。
" i% ~; s( }6 ]) ]% [7 u②多菌种任意混合，生产微生物添加剂。如目前国内生产的益生素制品含有5科10属80多种微生物，其菌种也未经过鉴定和安全性评价，使用此类产品存在潜在的风险。建议益生素生产企业在复合菌制剂时，要进行科学合理的设计，使用什么样的菌种、用几个、如何进行工艺控制等都要周密考虑。) u  j* s# e% @  `/ e# r
③生产工艺简单，质量控制不严。目前的生产工艺流程主要有固体发酵、液-固发酵(即先进行液体发酵，然后接种到固体培养基上放大发酵)和液体发酵几种生产工艺。8 ?9 d5 [& w; t4 `4 N  {( o
固体表面发酵法：是把固体表面培养物与载体按比例混合经干燥制成，此法生产的产品目标微生物的含量低，易受杂菌污染，质量难以控制，不适于工业化生产，但投资少。这是目前大部分微生物生产厂家所采用的方法，也是目前影响微生态制剂推广应用的主要不利因素。+ N# u* ?/ Z5 L+ @" C  Y& s% ?
应采取的正确工艺路线是液体深层高密度发酵，即：祖代菌种冻干粉→活化→纯化→接种摇甁→一级种子或二级种子(在发酵罐中进行)→生产罐发酵→发酵液→后加工(或喷雾干燥、或浓缩后冷冻干燥、或载体吸附干燥、或微胶囊包被)→筛分→质检→微生态产品。此法适于工业化生产，便于无菌操作，但成本高，生产过程能够严格控制，目标菌(有效菌)含量高，杂菌少，菌种纯度高，功效明确，也是技术和资金力量较强的企业采取的生产工艺。例如，由中国农业大学承担完成的国家“863”高技术计划和农业“跨越计划”——“安全高效微生物饲料添加剂‘益生康’中试放大产业化和应用技术”就是应用这种技术方案。一些发达国家和地区如美、日、欧等生产的高品质微生态制剂也是如此。
# E. R/ C4 P, p, h) @- o生产工艺条件对质量很大影响, 如发酵温度和时间会影响产品的质量，干燥工艺和温度和时间会影响微生物的存活率和活性。例如，使用嗜酸乳酸杆菌，在37℃培养12h与32℃培养48h的同一出发菌株，其终端代谢产物和作用效果有很大不同。
/ W' r: f. w8 I7 }④干燥方式不科学。干燥过程最易引起菌种存活率降低，目前常用的干燥方式为喷雾干燥和冷冻干燥。
5 p! ?" g  {" x喷雾干燥导致菌种的存活率偏低，大多数嗜温菌的存活率仅为10%，某些乳酸菌的存活率为44%。冷冻干燥由于是在低温下进行，可提高存活率，绝大多数菌种均可通过冷冻干燥而保存。# z: ~* `- `6 P" W  j) Y
⑤产品包装和剂型不规范　: N- C2 I8 K1 V% {
由于大多数微生态制剂对空气中的氧敏感,因而应选用密封防潮性能好的包装材料。塑料薄膜因其透气性、透湿性、化学稳定性和耐热性较差,不宜作为微生物的包装材料,而应选用密封防潮性能好的铝箔或高质量密封好的无毒塑料甁的作为包装材料。2 c1 I& b% Z4 g$ s( j+ k
剂型以微胶囊和双层胶囊为理想，其它如粉状和粒状都不耐加工和贮存。- t# ?2 H1 M% c: ^- n
随着微囊工艺、缓释技术和基因工程等新技术的发展, 这些新技术也将在微生态制剂产业中得到广泛应用。8 Y& x: p! P* b
3.6 微生态产品标示不明确或标示值(label claims)与实际含量(actual contents)不符微生态产品应明确标示产品相关信息，包括：
3 `* Y/ B/ `6 O0 @菌种名称：标准的中文菌种名称、拉丁文菌种名称以及菌种来源。7 o6 u; d  q( z2 k& ~
有效菌数和活力：产品应标示在产品保质期内的有效菌数即产品标示值(label claims)或保证值，即微生态制剂中能添加饲料中有效活菌数(指每克成品当中所含有的有效活菌数量)。国内一些益生素产品的实际活菌数远远低于其标示值，问题比较突出。在国外，南非的Elliot and Teversham(2004)评价了9个从美国和欧洲进口的益生素产品，结果发现仅有5/9产品的标示值与实测值相符，3/9的产品标示的菌种与实际相符。 6 b( G6 H# o. \1 X
此外，还包括产品功效、配伍禁忌、使用方法、产品保质期、生产日期等。
% e$ [2 o& a% b4  对国内微生态行业的几点建议    如前所述，随着抗生素的负面影响暴露的越来越多，微生态制剂必将在替代抗生素、提高饲料和食品安全等方面发挥重要作用。但是，微生态产业目前存在一系列问题，为了促进微生态产业的健康发展和发挥其优势作用，提出如下建议，以供本行业和政府部门参考。* c, G) J  j' F+ O7 Z" g7 E5 L' J
4.1 尽快建立有关产品标准国家有关部门尽快建立饲用微生物和微生物饲料添加剂质量监督检验测试中心，组织专家建立有关微生态产品标准、生产工艺标准，这是国家对微生态制剂实行监督的准绳，也是国家对微生态制剂生产和质量的最低要求。微生物标准化是组织微生物生产和提高制品质量的重要手段,在饲料添加剂行业标准尚未建立之前，可参照FAO/WHO制订的评价标准《Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food》或国内医药行业《生物制品试行规程》，它是我国生物制品的国家标准和技术法规，包括生产和检定的技术指标。它来源于生产，反过来又指导生产，不但规定了生产和检定技术指标，还对原材料、工艺流程、检定方法等作了详细的规定，对制品质量起到保证作用。, Q2 I- `7 J1 \3 M) X
4.2 政府部门加强市场监督政府有关部门通过加强对饲料添加剂生产企业的管理，对生产企业的生产条件应严格按兽药生产规定和符合GMP标准。
# H# f& Q8 N* M: p3 [严格把好微生物产品批准文号的审批关，要求生产企业提供产品的详细资料，如菌种的来源和筛选、菌株的诱变、菌株配伍以及产品的毒理学和流行病学研究的资料。对企业的产品生产和研发过程中进行安全监控，并严厉打击假昌伪劣产品产品流入市场。) y/ v# e* c$ m9 T% k
4.3 微生态制剂生产企业尽快生产出标示规范、安全高效的名优产品，占领和引导市场。企业应根据微生态制剂的法定标准和自身的生产工艺制定高于法定标准的内控标准。严格按照制定的标准对原辅料、包装材料、中间体、半成品和成品进行检验。加强生产过程中的质量监督,生产出安全高效的微生态制剂产品。
$ ~; U4 G7 H% Y2 t# }( d4.4 增加饲料生产企业和养殖户对微生物的科学认识，达到合理使用，发挥效益。微生物作为饲料添加剂可改善动物肠道微生态环境、提高营养物质消化率，增强机体免疫力、清除体内毒素，提高宿主对疾病抵抗力而逐渐在生产中应用。其使用效果与添加微生物的数量密切相关，数量不足在体内不能形成优势菌群， 难以起到益生作用； 然而杂菌数量过多，反而会引起仔畜禽腹泻或消耗营养，甚至影响了动物的生长发育。此外，还应针对不同的畜禽和不同生长阶段，合理选择使用微生物品种和数量，以使经济效益最大化。# K2 c) H: }$ E
相信，只要有高质量的微生物种、科学合理的生产工艺、严格的质控措施和正确的使用方法，益生素产业一定会有强劲的生命力，并在促进饲料工业和畜牧业绿色化中发挥重要作用。

cat918

恩，学习一下。谢谢