甜菜碱药物分析进展

wlei908

甜菜碱药物分析进展

关键词】
甜菜碱
提取分离
定量
高效液相色谱法

甜菜碱（betaine，Bet）又名甘氨酸甜菜碱、甜菜素，化学名称是三甲基氨基乙酸或三甲铵乙内酯，19世纪最早发现于欧洲，是一种季铵型水溶性生物碱，广泛存在于动植物和微生物体内。其分子式为C5H11NO2，结构式为（CH3）3N+CH2COO?，外观物理形状呈流动性，为鳞状或棱状白色结晶，易溶于水和甲醇，由于常温时极易吸湿潮解，应用时常将其制成甜菜碱盐酸盐（盐酸甜菜碱）。自上世纪70年代以来，甜菜碱的研究渐成热点，已被广泛应用于畜牧、医药、农林、食品和日化等领域。特别是在医药领域，甜菜碱许多优良的药理作用被相继发现，可用于对抗高同型半胱氨酸综合症，能保肝护肾、保持心脏与血管健康、维护消化系统、抑瘤抗癌、降压镇静、解热镇痛、耐缺氧、保护细胞抵抗高渗等等。体内组织或排泄物中甜菜碱的测定有助于临床上诊断人体内代谢异常与否［1］，许多甜菜碱药效研究需要对其进行治疗药物监测，这都涉及到甜菜碱的分析测定。如何更准确、简单、快速、经济地从生物样品中分离并定量甜菜碱，一直是学者们努力的方向。

    1   从生物样品中提取分离甜菜碱

基于甜菜碱的溶解性特点，从生物样品中提取甜菜碱最常用的方法有水提和醇提两种，如Hitz和Hanson［2］将生物样品90℃水浴1h，冷却后研磨，2 ℃去离子水浸提共3次，最后65 ℃减压浓缩；最早提出提取甜菜碱方法的Pearce等［3］使用甲醇对生物样品反复提取3次，然后于65 ℃减压浓缩。国内有用碱性三氯甲烷提取甜菜碱的报道［4］,朴茨茅斯大学的杨昕等［5］则采用了混合提取法，将甲醇?氯仿?0.2 mol·L?1碳酸氢钾（12：5：1 v/v）加入生物样品，60 ℃分别提取2次，然后用甲醇?水（1：1 v/v）60 ℃加热提取，取得较好效果。

基于甜菜碱的两性季铵型生物碱的特殊结构，对其分离纯化大多使用离子交换法。该方法是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,经过交换平衡达到分离目的的一种柱色谱法［6］。Horst［7］、刘新亚等［8］、尹昆等［9］分离提纯甜菜碱均使用了此类方法，都是将提取液依次通过强碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂，最后用氢氧化铵洗脱。此法能除去提取液中的氨基酸、蛋白质、多糖和苷类等成分，最终使测量结果准确可靠。吴志荣［10］、杨东辉［11］则利用了薄层层析法来分离纯化甜菜碱，但如何选择优良的展开剂、显色剂仍是制约该法的一个瓶颈。另外谷大建等［12］采用Oasis HLB固相萃取小柱对样品进行纯化，得到较好的效果。

    2  甜菜碱定量分析方法

对于甜菜碱的定量测定，自Pearce等发布碘量法［3］以来，又出现了可见一紫外分光光度法［13?14］、薄层扫描法［15］、非水滴定法［16］等许多分析方法，目前的主流方法是高效液相色谱（HPLC）法。

    2.1  高效液相色谱（HPLC）法

该法准确、快速，再现性高，可连续进样，能满足体内药物分析大样本快速分析要求。根据选用色谱柱、检测器种类及是否对甜菜碱进行衍生化，目前HPLC法大致分为以下几种方案。

    2.1.1  反相C18柱?紫外检测器?直接测定

陈少良等［17］在测定甜菜碱时采用的流动相为50 mmol·L?1KH2PO4(pH4.45)和0.1%PIC B_8(辛烷磺酸)，流速0.7 ml·min?1,检测波长为192 nm，测得甜菜碱的保留时间为6.3 min,加样回收率达到90 %左右；尹昆等［9］、谷大建等［12］均采用类似的方法，测得甜菜碱保留时间分别为2.5 min、4.01 min，加样回收率在90%以上。

    2.1.2  LC?SCX、CLC?ODS柱?紫外检测器?甜菜碱衍生化后测定

基于甜菜碱在近紫外区测定干扰大，保留时间短的特点，人们采用先将其衍生化再测定的方法。Laryea等采用［18］?冠醚?6及4?溴代苯甲酰甲基溴作为衍生试剂与样品和KH2PO4混匀后80 ℃加热60 min，制得甜菜碱的衍生物，使用强酸性阴离子交换色谱柱（LC?SCX），流动相为乙腈?水（90：10 v/v），10 mmol·L?1胆碱，流速1.5 ml·min?1,检测波长为254nm来测定血样和尿样中的甜菜碱含量，发现衍生物保留时间为14.8 min，检测最低限为5 μmol·L?1，效果良好。Lever等［19］、Mar MH等［20］亦采用这种方法对甜菜碱进行了成功检测。许明旺等［21］则采用了18?冠醚?6及2，4?溴代苯甲酰甲基溴作为衍生试剂，使用CLC?ODS色谱柱，流动相为乙腈?水(35：65,其中含有0.1 mol/L的NaClO4),流速1 ml·min?1,检测波长254 nm，测得衍生物保留时间为13 min，加样回收率在95%以上。姚少威等［22］采用相同的方法检测了复方枸杞颗粒中的甜菜碱含量，加样回收率亦在95%以上。

    2.1.3  胺基柱?紫外检测器?直接测定

廖国玲等［23］采用Lichrospher NH2色谱柱，以乙腈?水(85：15 v/v)为流动相，流速0.7 ml·min?1，检测波长195 nm，测定枸杞中甜菜碱，保留时间为16.58 min，平均回收率为98.9%，方法较为简单，重现性好。

    2.1.4  胺基柱?蒸发光检测器?直接测定

基于甜菜碱在近紫外区测定干扰大的特点，龚立冬等［24］使用蒸发光检测器代替紫外检测器，采用Waters Spherisorb S5 NH2色谱柱，流动相为0.1％(体积分数)三氟乙酸水溶液?甲醇(l5：85 v/v)，流速为0.6 ml·min?1，蒸发光散射检测器中漂移管温度90 ℃，测定肉苁蓉中的甜菜碱，加样回收率达到99%以上。李向阳等［4］也采用胺基柱、蒸发光检测器，流动相为乙腈?水(25：75 v/v)，流速1.0 ml·min?1，漂移管温度50 ℃，进行甜菜碱含量测定，加样回收率在97%以上。

    2.2  其他分析方法

    2.2.1  可见一紫外分光光度法

这种方法应用较早，主要利用样品与显色剂发生显色反应而生成有色物质，以便使用分光光度计进行测定。Barak等［13?14］处理后的肝组织样品与冷却的KH2混合产生碘化物沉淀，离心后用二氯乙烷溶解沉淀，在365 nm处测定吸光度，通过工作曲线计算出了甜菜碱含量。但该法干扰因素较多，特别是在测定低含量样品时误差较大。

    2.2.2  薄层扫描法

郭辉等［15］用0.5%羧甲基纤维素钠的硅胶G薄层板,以氯仿?甲醇?甲酸?水(2：8：2.2：0.5)为展开剂，以改良碘化泌钾溶液为显色剂，扫描波长为498 nm，对肝肾滋中的甜菜碱含量进行了测定。其最低检出限为22.8 μg，加样回收率在95 %以上。由于操作中难以保持展开温度、展开剂极性及蒸气压等诸多条件的恒定，该法重现性并不是很理想。

    2.2.3  非水滴定法

这是一种经济简便的测定方法，齐永秀等［16］以冰醋酸作为溶媒,以结晶紫作为指示剂,使用0.1 mol·L?1标准高氯酸溶液滴定并考察了不同厂家生产的盐酸甜菜碱的纯度，平均回收率为99.81%,相对标准偏差(RSD)为0.19%。该法稳定性及重现性较好，但无法满足大样本连续分析的要求。

    2.2.4  微型电极法

国外学者［25］曾用此法测定了甲基胺混合物中甜菜碱的含量。该法以甘汞电极为参比电极,玻璃微型电极为测定电极,用双静电计记录电压的方法测定甜菜碱含量,具有响应快、灵敏度高的特点，但前处理过程麻烦，也无法满足大样本连续分析的要求。

    2.2.5  质谱法与核磁共振法

质谱法通常与气相色谱仪或液相色谱仪联用来达到理想分离与精密测定的效果。Holm等［26］使用这种方法对血浆中的甜菜碱、胆碱、二甲基甘氨酸进行了测定。国外学者还利用1H NMR法测定了病人尿样中的甜菜碱［27］。不可否认这两种方法具有较高的精确性与灵敏度，但仪器较为昂贵，难以在大范围内推广。

    3  小
结

对甜菜碱的提取分离应结合具体生物样品及检测手段，随着检测手段的改进，提取分离也将趋向简单化、自动化。提取一般使用水、甲醇，而分离纯化一般使用离子交换树脂法，更为简单的SPE(固相萃取)法也将得到广泛应用。对甜菜碱进行测定一般使用HPLC法。基于甜菜碱的强极性特点，分析柱的选择越来越倾向于使用胺基柱，它能克服甜菜碱保留时间短，干扰大的缺点；对于仅配有紫外检测器的实验室来讲，从检测效果看衍生化法具有一定优势，国外尤为盛行，但操作复杂；如若克服使用近紫外检测干扰大的缺点，蒸发光检测器不失为一种良好选择。一般实验室如处理样品样本量少、对自动化要求不高，则非水滴定法、微型电极法可满足条件，且灵敏度较为理想。

secwind

好资料，谢谢LZ

波纵天下

东西已经分析到实质了。